ЭНДОФИТНЫЕ ГРИБЫ РАСТЕНИЙ РОДА Vinсa - ПРОДУЦЕНТЫ L-АСПАРАГИНАЗЫ

АННОТАЦИЯ

Эндофитные грибы рассматриваются как резервуар многочисленных активных метаболитов. Аспарагиназа используется в качестве противоракового препарата, особенно для лечения острого лимфобластного лейкоза. В статье представлены данные по отбору эндофитных грибов, выделенных ранее из растений рода Vinсa, продуцирующих L-аспарагиназу. Установлено, что из 17-ти исследованных эндофитов 14 штаммов внеклеточно продуцируют L-аспарагиназу с активностью в пределах 0,017 - 0,074 ед/мл среды. Полученные данные позволяют заключить, что эндофитные грибы растений рода Vinсa могут служить основой для разработки биотехнологии получения фермента L-аспарагиназы.

ABSTRACT

Endophytic fungi are considered as a reservoir of numerous active metabolites. Asparaginase is used as an anticancer drug, especially for the treatment of acute lymphoblastic leukemia. The article deals with data on the selection of endophytic fungi isolated earlier from plants of the genus Vinca producing L-asparaginase. It has been found that out of the 17 studied endophytes, 14 strains extracellularly produce L-asparaginase with activity in the range of 0.017 - 0.074 u/ml of medium. The obtained data allow us to conclude that the endophytic fungi of the Vinca plant can serve as a basis for the development of biotechnology for the production of the enzyme L-asparaginase.

Ключевые слова: растения рода Vinca, эндофитные грибы, L-аспарагиназа.

Keywords: plants of the Vinca genus; endophytic fungi; L-asparaginase.

Микроорганизмы, которые бессимптомно обитают внутри высших растений, известные как “эндофиты”, признаны богатыми источниками новых природных метаболитов, проявляющих разнообразную биологическую активность. Открытие эндофитов, как неиспользованного ресурса биологически активных молекул, означает, что все лекарственные средства, которые выделяют из растений, могут быть синтезированы из эндофитных грибов растений [7].

Особый интерес вызывают эндофиты растений с противораковой активностью, в связи с их способностью продуцировать широкий ряд веществ с антиканцерогенными свойствами. Около 19 различных типов химических классов обнаружены во вторичных метаболитах грибов, которые показали свои противораковые свойства против 45 различных клеточных линий рака. Некоторые из природных противораковых соединений - паклитаксел, подофиллотоксин, камптотецин, эргофлавин, свайнсонин, склеротиорин, флавонхризин, торрейовая кислота, винкристин и винбластин выделены из эндофитных грибов [27].

К числу известных антиканцерогенных соединений относится L- аспарагиназа (КФ 3.5.1.1) из класса амидогидролаз, гидролизующая аспарагин с образованием аспарагиновой кислоты (аспартата) и аммония (NH4+) [12]. Mashburn L.T. с соавт. выделили аспарагиназу из E.coli, и впервые сообщили о противолейкозных свойствах фермента [15]. Клинические данные, опубликованные за последние два десятилетия, свидетельствуют о том, что аспарагиназа является жизненно важным элементом в лечении острого лимфобластного лейкоза [11,17].

Как нормальным, так и лейкемическим клеткам для процесса пролиферации требуется аминокислота аспарагин. Нормальные клетки могут синтезировать аспарагин для своего роста с помощью аспарагинсинтетазы. В опухолевых клетках отсутствует аспарагинсинтетаза, поэтому их рост зависит от сывороточного аспарагина [7]. Введение аспарагиназы пациентам истощает аспарагин сыворотки, что приводит к ингибированию процесса пролиферации опухолевых клеток и их отмиранию [9].

Очищенная L-аспарагиназа из E. coli и Erwinia chrysanthemi использовалась клинически для лечения острого лимфобластного лейкоза, но у нее проявились побочные аллергические реакции на нативную L-аспарагиназу, что приводило к летальному исходу [1,18,19]. Серьезные побочные эффекты, связанные с бактериальной аспарагиназой, были связаны с прокариотическим происхождением очищенного фермента [1]. Следовательно, для получения аспарагиназы необходимо ориентироваться на грибы, как на безопасный альтернативный эукариотический источник [20].

Аспарагиназа была зарегистрирована у нескольких видов грибов, таких как Mucor hiemalis, Aspergillus niger, A. flavus, A. nidulans, A. terreus [4,8]. Balbool с соавт. провели скрининг 25 изолятов эндофитных грибов по способности продуцировать L-аспарагиназу. При этом 7 изолятов показали положительные результаты [4].

Moubasher с соавт. показали высокую активность внеклеточной аспарагиназы в Lasiodiplodia theobromae, в то время как Narayana с соавт. сообщили, что большая часть аспарагиназы локализована внутриклеточно. Поскольку внеклеточная аспарагиназа минимально взаимодействует с клеточными структурами, то и легче извлекается [1,3].

Таким образом, целью исследований стало изучение способности продуцировать внеклеточную L-аспарагиназу у эндофитных грибов из растений рода Vinca, и отбор наиболее перспективных штаммов.

Объект и методы исследований

Объектом исследования служили эндофитные грибы, выделенные ранее из различных частей растений рода Vinca - V. minor (барвинок малый), V. erecta (барвинок прямой) и V. rosea (барвинок розовый), произрастающих в Узбекистане [13].

Для предварительного скрининга эндофитов, продуцирующих L-аспарагиназу, использовали модифицированную агаризованную среду Чапека-Докса состава, г/л: агар (20,0), глюкоза (2,0), L-аспарагин (10,0), КН₂РО₄ (1,52) KCl (0,52), MgSO₄∙7H₂O (0,52), FeSO₄∙7H2O (0,001), CuNO₃∙3H2O (0,001.), ZnSO₄∙7H2O, содержащую 0,3 мл 2,5% фенолового красного индикатора, рН среды - 6,2. Контроль - без добавления аспарагина. Посев проводили методом укола в чашки. Все инокулированные чашки выращивали в термостате при 28 °С 5 суток. Результат оценивали визуально по размеру и интенсивности розового окрашивания вокруг роста грибных колоний [14].

Для количественной оценки уровня L-аспарагиназной активности отобранные штаммы культивировали 5 дней на 30 мл жидкой, модифицированной среде Чапека-Докса при 120 об/мин. После инкубации 200 мкл культуральной среды вносили в 2 мл микроцентрифужные пробирки, содержащие 200 мкл Tris HCl (pH 7,2), 400 мкл 0,04 µ аспарагина и 200 мкл стерильной дистиллированной воды. Смесь инкубировали при 37 ± 2 °С в течение 1 ч. После инкубации добавляли 200 мкл 1,5 µ трихлоруксусной кислоты для остановки ферментативной реакции. Затем пипеткой отбирали 200 мкл смеси в пробирки, содержащие 1,5 мл дистиллированной воды и 600 мкл реактива Несслера. Пробирки инкубировали при 28 ± 2 °С в течение 20 мин. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре при 450 нм. Одна единица аспарагиназы выражалась как количество фермента, катализирующего образование 1 µмоль аммиака в минуту при 37± 2 °С по формуле:

Единица/(мл фермента)=((µмоль NH3)∙(1,2))/(0,2∙60∙0,4)

0,6 - начальный объём ферментной смеси, мл

0,2 - объём ферментной смеси, используемой в конечной реакции, мл

60 - время инкубации, минуты

0,4 - объём фермента, мл

Значения выражены как среднее арифметическое трёх вариантов опыта.

Результаты и их обсуждение

О способности эндофитных грибов синтезировать L-аспарагиназу сообщалось ранее в ряде работ. Так, Chow and et al. выделили эндофитные грибные изоляты из четырех растений C. citratus, M. koenigii, O. diffusa и P. bleo с противораковой активностью. Полученные данные показали, что 25 из 89 выделенных грибных морфотипов продуцировали L-аспарагиназу в пределах от 0,0069 до 0,025 ед/мл [22]. Uzma с соавт. из шести дикорастущих лекарственных растений Западного Гата, Индия, выделили 112 эндофитных грибов, принадлежащих к 26 родам. Выделенные изоляты грибов были проверены на продукцию внеклеточных ферментов, из них 40% изолятов проявляли L-аспарагиназную активность [23]. Продукция L-аспарагиназы была показана в эндофитных грибах, выделенных из Tinospora cordifolia. Из 25 изолятов один изолят ABR4 (F. solani) продемонстрировал максимальную выработку L-аспарагиназы, составившую 0,7 ед/мл на 6-ой день при глубинной ферментации [16].

Полученные нами изоляты эндофитных грибов предварительно подвергали скринингу на способность продуцировать L-аспарагиназу с помощью качественного экспресс-анализа на чашках. Из 17-ти грибковых эндофитов, протестированных на активность L-аспарагиназу, у 14 изолятов наблюдалось появление розового окрашивания агара, что свидетельствует о продукции внеклеточной L-аспарагиназы (рис. 1.)

А                                             Б

Рисунок 1. Качественный анализ на L-аспарагиназу изолятов, выделенных из растений рода Vinca
 (A) Изоляты, не проявляющие L-аспарагиназную активность; (Б) изоляты демонстрирующие высокую продукцию. Слева направо: контроль – агаризованная среда, штаммы - Sclerotium minorum – VM83R, Penicillium aurantiogriseum -VM22F, Alternaria sp. – VE98L, Penicillium citreonigrum - VM18S, Acremonium sp. – VM96L

При количественной оценке активности L-аспарагиназы данные качественного анализа получили подтверждение. Действительно, 14 изолятов проявляют внеклеточную аспарагиназную активность в пределах 0,017–0,074 ед/мл при глубинной ферментации на модифицированной среде Чапека-Докса (табл.1). Максимальная ферментативная активность, составившая 0,074 ед/мл, была отмечена у штамма Aspergillus terreus - VE90R, выделенного из V. erecta (0,074 ед/мл). Штамм Alternaria sp. – VM85L проявил наименьшую активность при концентрации фермента 0,017 ед/мл.

Таблица 1.

Качественный и количественный анализ на L-аспарагиназу грибных изолятов, выделенных из растений рода Vinca

«+» - слабая интенсивность окрашивания

«++» - средняя интенсивность окрашивания

«+++»- сильная интенсивность окрашивания

В сравнительном аспекте, полученные данные свидетельствуют о более высокой активности L-аспарагиназы эндофитных грибов из растений Vinca, чем из эндофитов ряда других растений с противораковой активностью, представленных в ряде сообщений [22,23,26].

Следует отметить, что ранее нами было установлено, что наиболее активный по L-аспарагиназе эндофит A.terreus - VE90R, также продуцирует противораковые винка-алкалоиды - винкристин и винбластин [13]. Следовательно, продукция этим эндофитным грибом противораковых соединений различной природы, в совокупности, может усиливать полезные свойства этих штаммов для создания на их основе противораковых терапевтических средств.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что продукция L-аспарагиназы эндофитными грибами, выделенными из противораковых растений рода Vinca, может служить альтернативным потенциальным источником этого фермента. Необходимы дальнейшие исследования, направленные на оптимизацию условий продукции L- аспарагиназы, выделение и характеристику кинетических свойств фермента.

Список литературы:

1. Archana, J.; Raja, P. Production, Purification and Characterization of L-Asparaginase from Aspergillus nidulans by Solid State Fermentation. Eur. J. Biotechnol. Biosci. 2014, 2, 51–58.
2. Arnold AE. 2007. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress,challenges, and frontiers. Fungal Biology Review 21:51–66
3. Balbool, B.A.; Abdel-Azeem, A.M. Diversity of the Culturable Endophytic Fungi Producing L-Asparaginase in Arid Sinai, Egypt. Ital. J. Mycol. 2020, 49, 8–24. [CrossRef]
4. Balbool, B.A.; Abdel-Azeem, A.M. Diversity of the Culturable Endophytic Fungi Producing L-Asparaginase in Arid Sinai, Egypt. Ital. J. Mycol. 2020, 49, 8–24. https://doi.org/10.6092/issn.2531-7342/10063
5. Batool T, Makky EA, Jalal M, Yusoff MM. 2015. A comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Applied Biochemistry Biotechnology 178(5):900–923.
6. Chow YY., Ting A.S.Y. Endophytic l-asparaginase-producing fungi from plants associated with anticancer properties. Journal of advanced research. Vol 6, Issue 6, 2015, pp. 869-876
7. Faeth S.H., Fagan W.F., 2002. "Fungal Endophytes: common host plant symbionts but uncommon mutuslists". Intrgr. Comp. Biol.42, PP: 360-368.
8. Gaber, A.; Alsanie, W.F.; Kumar, D.N.; Refat, M.S.; Saied, E.M. Novel Papaverine Metal Complexes with Potential Anticancer Activities. Molecules 2020, 25, 5447, doi:10.3390/molecules25225447.
9. Gary Strobel, Bryn Daisy. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products// Microbiol mol biol rev 2003; 67:4:491-502
10. Holker U, Hofer M, Lenz J. 2004. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid- state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology 64:175–186
11. Huang, L.; Liu, Y.; Sun, Y.; Yan, Q.; Jiang, Z. Biochemical Characterization of a Novel L-Asparaginase with Low Glutaminase Activity from Rhizomucor miehei and Its Application in Food Safety and Leukemia Treatment. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 80, 1561–1569.
12. Kumar, D.; Sobha, K. L-Asparaginase from Microbes: A Comprehensive Review. Adv. Biores. 2012, 3, 137–157.
13. L.I.Abdulmyanova , N.N.Teomashko , E.O.Terentyeva , D.M.Ruzieva , R.S.Sattarova , Sh.S.Azimova and T.G.Gulyamova 2015. «Cytotoxic Activity of Fungal Endophytes from Vinca». Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (2015) 4(7): 321-329.
14. Lubkowski J., Dauter M., Aghaiypour K., Wlodawer A., Dauter Z. Atomic resolution structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2003; 59 (Pt 1): 84–92.
15. Mashburn LT, Wriston JC (1963) Tumor inhibitory effect of L-asparaginase. Biochem Biophys Res Commun 12(1):50–55
16. Moubasher, H.A.; Balbool,B.A.; Helmy, Y.A.; Alsuhaibani, A.M.;Atta, A.A.; Sheir, D.H.; Abdel-Azeem,A.M. Insights into Asparaginase from Endophytic Fungus Lasiodiplodia theobromae: Purification, Characterization and Antileukemic Activity. Int. J. Environ. Res. Public Health 2022, 19, 680.
17. Nagarajan, A.; Thirunavukkarasu, N.; Suryanarayanan, T.S.; Gummadi, N.S. Screening and Isolation of Novel Glutaminase Free L-Asparaginase from Fungal Endophytes. Res. J. Microbiol. 2014, 9, 163–176
18. Nagarajan, A.; Thirunavukkarasu, N.; Suryanarayanan, T.S.; Gummadi, N.S. Screening and Isolation of Novel Glutaminase Free L-Asparaginase from Fungal Endophytesitle. Res. J. Microbiol. 2014, 9, 163–176.
19. Saied, E.M.; El-Maradny, Y.A.; Osman, A.A.; Darwish, A.M.G.; Abo Nahas, H.H.; Niedbała, G.; Piekutowska, M.; Abdel-Rahman, M.A.; Balbool, B.A.; Abdel-Azeem, A.M. A Comprehensive Review about the Molecular Structure of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): Insights into Natural Products against COVID-19. Pharmaceutics 2021, 13, 1759, doi:10.3390/pharmaceutics13111759.
20. Salini, G.; Madhusoodhanan, A.; Joseph, A.; Mohan, A.; Navya, R.K.; Nair, V.V. Glutaminase Free L-Asparaginase Producing Endophytes from Mangroves. Asian J. Pharm. Clin. Res. 2016, 9, 360–362.
21. Swain A.L., Jaskólski M., Housset D., Rao J.K., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy// Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90 (4): 1474–8.
22. Tan ML, Sulaiman SF, Najimuddin N, Samian MR, Tengku Muhammad TS. Methanolic extract of Pereskia bleo (Kunth) DC. (Cactaceae) induces apoptosis in breast carcinoma, T47-D cell line. J Ethnopharmacol 2005;96:287–94
23. Theantana T, Hyde KD, Lumyong S. Asparaginase production by endophytic fungi from Thai medicinal plants: cytotoxicity properties // Int J Integr Biol 2009;7:1–8
24. Uzma F., KonappaТ.С, Chowdappa S. Diversity and extracellular enzyme activities of fungal endophytes isolated from medicinal plants of Western Ghats, Karnataka. Egyptian journal of basic and applied sciences 3 (2016) 335 – 342
25. Uzma F., Murthy K.N and C. Srinivas. Optimization of physiological conditions for L-asparaginase production by endophytic fungi (Fusarium solani) isolated from Tinospora cordifolia (Willd.) Hook & Thomson/
    European Journal of Experimental Biology, 2016, 6(3):37-45
26. Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent // Crit Rev Biotechnol 2007; 27 (1): 45–62.
27. Zhang HW, Song YC, Tan RX. 2006. Biology and chemistry of endophytes. Journal of Natural products 23:753–771.