ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ КВЕРЦЕТИНА НА ОТДЕЛЬНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ТКАНИ МОЗГА ЖИВОТНЫХ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛЬЮ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО СОСТОЯНИЯ

АННОТАЦИЯ

Целью работы явилось исследование влияния модели нейродегенеративного состояния (НДС) на липидный состав, активность ПОЛ и ферментов антиокислительной системы нигростриатного участка ткани мозга и на параметры поведенческой активности животных, а также разработка способа коррекции возникающих изменений с помощью интраназального введения липосомальной формы кверцетина.

ABSTRACT

The goal of the article is to study the effect of the neurodegenerative state (NDS) model on the lipid composition, the activity of LP and enzymes of the antioxidant system of the nigrostriatal area of brain tissue and on the parameters of behavioral activity of animals, as well as to develop a method for correcting emerging changes using intranasal administration of the liposomal form of quercetin.

Ключевые слова: нейродегенеративное состояние (НДС), поведенческие и когнитивные тесты, липидный состав, перекисное окисление липидов (ПОЛ), антиоксидантная система (АОС), супероксиддисмутаза (СОД), липосомы, кверцетин, биологически активные вещества (БАВ).

Keywords: neurodegenerative state (NDS); behavioral and cognitive tests; lipid composition; lipid peroxidation (LP); antioxidant system (АS);  superoxide dismutase (SOD); liposomes; quercetin; biologically active substances (BAS).

Введение

Нейродегенеративные заболевания занимают важное место среди причин, вызывающих снижение трудоспособности и повышение смертности населения. Многочисленные работы, направленные на ииследование причин возникновения нейродегенеративных состоянияй (НДС), позволили собрать материал, касающийся факторов, лежащих в основе возникновения этих заболеваний, но понимание механизмов данного процесса остается далеко неполным. В качестве основных моментов развития НДС рассматривается агрегация β-амилоидного белка, гиперфосфорилирование белка тау, активация свободнорадикальных процессов, изменения в сфингомиелиновом цикле, активация микроглии и воспалительных процессов [16; 15; 7; 1]. Учитывая это, настоящая работа посвящена исследованию влияния модели НДС на липидный состав, активность ПОЛ и ферментов антиокислительной системы нигростриатного участка ткани мозга и на параметры поведенческой активности животных, а также разработке способа коррекции возникающих изменений с помощью интраназального введения липосомальной формы кверцетина. Выбор кверцетина обусловлен не только тем, что он обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, но и в связи с тем, что в настоящее время существуют коммерческие препараты кверцетина в липосомальной форме, которые используются при лечении офтальмологических и дерматологических заболеваний [10; 6], и разработка способа применения липосомальной формы кверцетина при лечении нейродегенеративных заболеваний, на наш взгляд, является перспективной.

Материалы и методы

В работе были использованы беспородные крысы самцы весом 300–350 граммов, которые содержались на стандартной диете с добавлением холестерина в количестве 2% от объема пищи. Эксперименты на животных были одобрены представителями биоэтической комиссии по работе с лабораторными животными при локальном этическом комитете ИББ при Национальном университете Узбекистана имени Мирзо Улугбека и проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные содержались в хорошо вентилируемом, освещенном, отапливаемом помещении со своевременной уборкой, при 12-часовом световом цикле, не более пяти голов в одной клетке и имели свободный доступ к пище и воде.

До моделирования НДС животные прошли поведенческие тесты для выборки животных для последующих экспериментов [2]. После выборки 26 крыс были разделены на группы: активный контроль (КГ) – 5 голов: животным вводили интраназально физиологический раствор с диметилсульоксидом (ДМСО) (8:2 по объему) и экспериментальная группа (ЭГ) с суммарным средним баллом по шкале Stroke-index McGrow 2,5 [12], которая была разделена на 3 группы по 7 голов: ЭГ вводили интраназально ротенон в дозе 1,5 мг/кг веса в течение 13 дней и на 14-й день добавляли бактериальный липополисахарид (ЛПС) E. coli в дозе 200 мкг/кг веса [9]. ЭГ+ЛКЦ – экспериментальная группа с интраназально введенной липосомальной формой кверцетина (ЛКЦ) через 60 минут после ротенона. ЭГ+КЦ – экспериментальная группа с введенным интраназально кверцетином (КЦ) через 60 минут после ротенона. Малые одноламеллярные липосомы (МОЛ) размером 150–200 нм готовили из сфингомиелина (0,053М), фосфатидилхолина (0,038 М) и холестерина (0,024 М), выделенных из мозга крупного рогатого скота, взятых в мольном соотношении 7:5:3 и общей концентрацией липидов 50 мг/мл. В липидную пленку (СФ : ФХ : ХС) добавляли растворенный в физиологическом растворе и в ДМСО (8:2) кверцетин и в течение 10 мин при низких температурах обрабатывали ультразвуком при 22 кГц [3]. Невключенную часть кверцетина отделяли равновесным диализом, количество включенного кверцетина, которое составляло 60% от исходной величины, определяли тонкослойной хроматографией (ТСХ), как описано в работах [4; 18]. Липосомальную форму кверцетина (КЦ) в дозе 3,0 мг/кг веса и кверцетин без липосом в дозе 5,0 мг/кг веса вводили через 60 минут после введения ротенона и ЛПС интраназально. В течение всего периода эксперимента наблюдали за поведением животных проведением на 3, 6, 9 и 16-й день поведенческих тестов: тест «Открытое поле» (ОП), «Крестообразный лабиринт» (КЛ), тест «Условная реакция пассивного избегания (УРПИ)» и тест «Условная реакция активного избегания (УРАИ)» [18] – для мониторинга воспроизведения модели НДС и исследования влияния кверцетина. Материалы нигростриатной системы мозга для биохимических исследований забирались на 16 день после начала введения ротенона. Животных забивали под наркозом. Экстракцию общих липидов и фракционирование отдельных классов липидов проводили методом тонкослойной хроматографии по [8]. Количественное содержание липидов и белка – по [13]. Исходный уровень и наработку субстратов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), – по [11], активность ферментов АОС: каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатиопероксидазы (ГП) – по [5; 19; 17). Оптические измерения проводили на спектрофотометре Cary 60 Agilent Texnology. Обработку результатов исследования проводили определением статистической значимости различий средних величин, а также используя программу Origin 6.1. Для оценки достоверности (значимости) различий двух средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при p≤0,05.

Результаты исследования

Исследование поведенческой активности (моторные тесты) животных в тесте «Открытое поле» до и после воспроизведения НДС и введения интраназально липосомальной формы кверцетина показало следующее (см. табл. 1).

Таблица 1.

Признаки поведенческой активности животных в тесте «Открытое поле»

Примечание: * – наблюдаемые различия статистически значимы, уровень значимости р<0,05.

КГ – группа с итраназально введенным физраствором с ДМСО, ЭГ – экспериментальная группа с введенным интраназально ротеноном + ЛПС, ЭГ–ЛКЦ – группа с интраназально введенной липосомальной формой КЦ, ЭГ+ КЦ – группа с интраназально введенным кверцетином.

Наблюдается заторможенность реакции животных: олигокинезия, увеличение латентного периода при посадке животных в установку ОП, уменьшение числа переходов и пересеченных квадратов, снижается норковый рефлекс. У 5% животных экспериментальной группы наблюдался в начальные периоды воспроизведения модели тремор конечностей и у 10% – ригидность мышц туловища, которую оценивали по выраженности симптома «горбатости» в баллах сопоставлением длины туловища животных. У экспериментальной группы животных, которым через час после введения ротенона вводили кверцетин в липосомальной форме (ЛКЦ) и кверцетин без липосом (КЦ), значения исследованных параметров поведенческой активности в тесте ОП изменяются незначительно (см. табл. 1), приближаясь по абсолютным величинам к параметрам группы активного контроля. При этом влияние ЛКЦ при малой дозе активного вещества было более эффективным, чем при введении КЦ.

Исследование поведения животных (эмоционально-мотивационные тесты) в крестообразном лабиринте (см. табл. 2) и при проведении тестов УРПИ и УРАИ (см. табл. 3) показало следующее.

Таблица 2.

Результаты исследования теста поведения животных в крестообразном лабиринте (КЛ)

Примечание: * – наблюдаемые различия статистически значимы между КГ и ЭГ, уровень значимости р<0,05.

В контрольной группе крыс при повторной посадке в крестообразный лабиринт с открытым новым рукавов не было заметных изменений во времени нахождения в рукаве: животные с любопытством осматривали и обнюхивали новый рукав. Экспериментальная группа животных быстро покидала новый рукав, не проявляя любопытства к новым условиям и запахам, что свидетельствует о нарушении в ЭГ животных памяти и ориентации. У крыс, которые получали интраназально в липосомальной форме кверцетин, наблюдалась тенденция в увеличении времени исследования новых рукавов в сравнении с экспериментальной группой, что свидетельствует о способности этих препаратов ослаблять влияние нейротоксинов на память и ориентацию животных (табл. 2).

Таблица 3.

Результаты исследования тестов УРПИ и УРАИ в группе активного контроля, экспериментальной группе (ЭГ) и в группе ЭГ, которым вводили липосомальную форму кверцетина и кверцетин

Примечание: * – наблюдаемые различия статистически значимы между группами и уровень значимости р<0,05.

Установлено, что в группе активного контроле при проведении теста УРПИ после восьми повторов посадок животных в светлую часть камеры, с последующим болевым раздражителем в темной части камеры, к концу эксперимента только в 21,2% случаев животные заходили в темную часть камеры, в 78,1% случаев проведения теста память о болевом раздражителе сохранялась. В экспериментальной группе животных в 77,5% случаев крысы заходили в темную часть камеры, что свидетельствует о том, что условный рефлекс на болевой раздражитель сохранился у только у 28,1% животных.

Интраназальное введение липосомальной формы кверцетина экспериментальной группе крыс (ЭГ + ЛКЦ) через час после ротенона в течение 14 дней приводило к тому, что безусловный рефлекс (заход в темную часть камеры) сохранился в 35,3% случаев проведения теста УРПИ, при этом в 65,2% случаев животные не заходили в темную часть камеры и память о болевом раздражителе сохранилась. При введении кверцетина без липосом группе крыс с ротеноном (ЭГ–КЦ) в 52,5% случаев животные не заходили в темную часть камеры в остальных случаях проведения теста, очевидно, память о болевом раздражителе не сохранилась. В контрольной группе крыс при обучении условной реакции активного избегания (тест УРАИ), критерия обученности (после 8 повторов) к концу эксперимента обучения достигли 79% крыс, а количество отказов от выполнения адекватных реакций составляло 8,1%. Обучение УРАИ животных экспериментальной группы (получавших ротенон + ЛПС) проходило значительно медленнее, и к концу эксперимента, после восьми повторов обучения, только у 27% животных достигли критерия обученности УРАИ при увеличении числа отказов от выполнения адекватных реакций. В группе крыс, получавших одновременно с ротеноном ЛКЦ и КЦ, критерий обученности при тех же условиях составил 68 и 55% соответственно.

Таким образом, результаты этой серии экспериментов показывают, что ЛКЦ и КЦ, введенные интраназально, проявляют протекторные свойства, снижая нейротоксическое действие ротенона и ЛПС. При этом доза ЛКЦ, которая вызывает положительное инотропное действие, при воспроизведении модели НДС меньше, чем кверцетина без липосом. Это, возможно, связано с более эффективным проникновением липосомальной формы кверцетина через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему и дополнительным влиянием самих липосом, которые могут выполнять роль антиоксидантов, поглощая возникающие активные радикалы, и встраиваться в мембраны клеток, восстанавливая микровязкость отдельных участков мембран. В следующей серии экспериментов были исследованы липидный состав, активность ПОЛ и ферментов АОС нигростриатной системы мозга животных.

Таблица 4.

Липидный состав стриатного участка мозга животных после воспроизведения модели НДС и введения липосомальной формы кверцетина и кверцетина

ЛФХ – лизофосфатидилхолины, ФХ – фосфатидилхолины, СФ – сфингомиелины, ФС – фосфатидилсерины, ФИ – фасфатидилинозиты, ФЭА – фосфатидилэтаноламины, ДФГ – дифофатидилглицериды, ФК – фосфатидная кислота, ОФЛ – общие фосфолипиды, ОХС – общий холестерин.

Примечание: * – наблюдаемые различия статистически значимы между КГ и ЭГ, уровень значимости р<0,05.

Из таблицы видно, что при воспроизведении модели НДС наблюдается достоверное увеличение содержания ЛФХ и ФК, содержание остальных фракциий и общее содержание фосфолипидов меняется незначительно, хотя наблюдается некоторая тенденция в увеличении содержания ФИ и уменьшении СФ и ФХ фракций, а также увеличение на 15% относительного содержания холестерина к сумме фосфолипидов. Возможно, при введении нейротоксинов на фоне повышения свободнорадикального окисления липидов (см. табл. 4) увеличивается активность фосфолипаз, что и приводит к повышению содержания ЛФХ и ФК и изменяется микровязкость мембран нервных клеток, вызывая повышение холестерина в этом участке ткани мозга.

Следует отметить, что эти изменения в липдном спектре ткани мозга, возможно, оказывают влияние на состояние рецепторных и синаптических участков мембран и на передачу сигнала нервными клетками, очевидно, этим можно объяснить наблюдаемые изменения в поведении животных при воспроизведении модели НДС.

Учитывая то что кверцетин и его метаболиты являются антиоксидантами, мы предприняли попытку исследовать влияние липосомальной формы кверцетина на активность ферментов АОС нигростриатной системы мозга животных с моделью НДС.

Исследование показателей ПОЛ и активности ферментов каталазы, СОД и глутатионпероксидазы (ГП) стриатного участка мозга животных при воспроизведении модели НДС и интраназальном введении липосомальной формы кверцетина животным показало следующее (см. табл. 5).

Таблица 5.

Содержание МДА и активность ферментов АОС в стриатном участке мозга животных с моделью НДС и при введении липосомальной формы кверцетина и кверцетина

Примечание: * – наблюдаемые различия статистически значимы между группами, уровень значимости р<0.,05.

Из таблицы видно, что при воспроизведении модели НДС увеличивается уровень окрашиваемых тиобарбитуровой кислотой продуктов на 79%, на фоне снижения активности ферментов антиоксидантной системы: каталазы – на 35% и СОД – на 24,7% и активности ГП на – 10,8% соответственно. При введении животным липосомальной формы кверцетина и кверцетина без липосом уровень МДА в нигростриатном участке ткани мозга снижается по сравнению с экспериментальной группой животных на 27,6% и на 16,0% и составляет 3,15 и 3,65 нмоль на мг белка соответственно. Липосомальная форма кверцетина, введенная после ротенона, увеличивает активность ферментов АОС по сравнению с экспериментальной группой животных, в частности каталазы и СОД, на 32 и 19% соответственно, активность ГП не изменялась и при воспроизведении модели НДС, и после введения кверцетина. Влияние кверцетина в нелипосомальной форме на исследованные биохимические показатели было менее значительным (см. табл. 4).

Заключение

Таким образом, при воспроизведении модели нейродегенеративного состояния введением ротенона и ЛПС наблюдается активация перекисного окисления липидов на фоне снижения активности ферментов АОС, что вызывает изменения в липидном составе нигростриатного участка ткани мозга. Эти изменения в липидном спектре, возможно, оказывают влияние на рецепторные и синаптические участки и на передачу сигнала нервными клетками, что мы и наблюдаем при исследовании поведенческой активности животных при воспроизведении модели НДС. Известно, что при энтеральном введении биологически активных веществ (БАВ) 80% активного вещества расщепляется в желудке и захватывается паренхиматозными тканями, и только 20% достигает цели.

Список литературы:

1. Алесенко А.В. Потенциальная роль сфинголипидов в нейропатогенезе болезни Альцгеймера // Биомедицинская химия. – 2013. – Т. 59, вып. 1. – С. 25–50.
2. Амикишиева А.В. Поведенческое фенотипирование: современные методы и оборудование // Информац. Вестн. ВОГиС. – 2009. – № 3. – С. 529–542.
3. Дубровина Н.И. Дофаминергические механизмы памяти и внимания / Н.И. Дубровина, Л.В. Лоскутова. – Новосибирск : Наука, 2003. – 278 с.
4. Изучение антиоксидантной и антирадикальной активности листьев Isatis Tinctoria L / М.А. Мустафакулов [и др.] // Universum: химия и биология. – 2022. – № 7-1 (97). – С. 40–44.
5. Методические положения по изучению процессов свободнорадикального окисления и системы антиоксидантной защиты организма. Метод определения малоновогодиальдегида в крови. – Воронеж, 2010. – С. 37–39.
6. Наумов А.А. Благотворное действие липосомальной формы дигидрокверцитина на процесс регенерации кожи после термического ожога // Цитология. – 2010. – Т. 52, № 4. – C. 311–316.
7. Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона / Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН; Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова. – СПб., 2011. – Т. 5, № 4. – С. 46–51.
8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / А.Н. Миронов [и др.]. – М., 2012. – Ч. 1. – С. 223, 278–280.
9. Способ моделирования нейродегенеративного поражения центральной нервной системы у крыс // Патент Республики Беларусь BY 11160 C1. 2008 / Мойсеенок А.Г, Омельянчик С.Н., Шевалье А.А., Евкович И.Н. [и др.].
10. Сравнительная фармакокинетика дигидрокверцетина у крыс после введения внутрь в виде субстанции и липосомального препарата Фламена D / В.П. Жердев, Г.Б. Колыванов, А.А. Литвин, А.К. Сариев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. – Т. 73, №1. – С. 23–25.
11. Handloser D., Widmer V., Reich E. Separation of phospholipids by HPTLC – an investigation of important parameters // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. – 2008. – Iss. 31. – P. 1857–1870.
12. McGraw C.P., Pashayan A.G., Wendel O.T. Cerebral infarction in the mongo- lian gerbil exacerbated by phenoxybenzamine treatment // Stroke. – 1976. – № 7 (5). – Р. 485–488.
13. Morris Kates. Techniques of Lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids. – Elsevier Publishing Co., Inc. New York, 1972.
14. Neurodegeneration type and severity have linkage with plasma insulin in DM patients / T. Saatov [et al.] // Endocrine Abstracts. – Bioscientifica, 2022. – Т. 81.
15. Overk C.R., Masliah E. Pathogenesis of synaptic degeneration in Alzheimer’s disease and Lewy body disease // Biochem. Pharmacol. – 2014. – Vol. 88. – P. 508–516.
16. Rates of b-amyloid accumulation are independent of hippocampal neurodegeneration / C.R. Jack, H.J. Wiste, D.S. Knopman [et al.] // Neurology. – 2014. – Vol. 82. – P. 1605–1612.
17. Rice-Evance C.A., Diplock A.T., Symons M.C. Techniques in free radical research. – Elsevier, Amsterdam, 1991.
18. Study on compositions of lipids in tissues of rats with alimentary obesity / S. Irgasheva [et al.] // Endocrine Abstracts. – Bioscientifica. – 2019. – Т. 63.
19. Study on some parameters of lipid metabolism in the cerebral tissues of rats with the rotenone-induced model of Parkinson’s disease / I.T. Mukhitdinovich [et al.] // European science review. – 2019. – Т. 2, № 1-2. – С. 15–19.
20. The effect of ngf on indicators of the antioxidant system in rat brain tissue / M. Mukhammadjon [et al.] // Universum: химия и биология. – 2021. – № 9 (87). – С. 82–86.