ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ В ЭКСКЛЮЗИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БИОАКТИВНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

АННОТАЦИЯ

Изучены полиэлектролитные свойства гепарина, сульфатированных и карбоксиметилированных производных хитозана и сульфатированного гуарового галактоманнана методом эксклюзионной хроматографии. Полиэлектролитные и электростатические эффекты были подавлены с использованием в качестве элюента водно-солевого раствора.

ABSTRACT

The polyelectrolyte properties of heparin, sulfated and carboxymethylated derivatives of chitosan, and sulfated guar galactomannan were studied by size exclusion chromatography. The polyelectrolyte and electrostatic effects were suppressed by using an aqueous salt solution as the eluent.

Ключевые слова: полисахариды, гепарин, сульфат хитозана, сульфат галактоманнана, карбоксиметилхитозан, эксклюзионная хроматография, электростатические эффекты, полиэлектролиты.

Keywords: polysaccharides, heparin, sulfate chitosan, sulfate galactomannan, carboxymethylchitosan, exclusion chromatography, electrostatic effects, polyelectro-lytes.

Актуальность

Эксклюзионная хроматография (ЭХ) является высокоэффективным методом разделения и исследования молекулярно-массовых характеристик (ММХ) полимеров [2]. Анализ водорастворимых как синтетических, так и природных полимеров в бессолевых растворах осложняется присутствием полиэлектролитных эффектов, таких как полиэлектролитное набухание, ионная эксклюзия и молекулярная адсорбция, которые нарушают молекулярно-ситовой механизм разделения ЭХ [7]. Если на поверхности сорбента имеется малое остаточное количество отрицательно заряженных групп, тогда при хроматографировании анионных полимеров может наблюдаться эффект ионной эксклюзии, который накладывается на полиэлектролитное набухание. В данном случае оба эффекта действуют в одну сторону, то есть в сторону уменьшения времени удерживания (элюции) образца. Как правило, для подавления указанных эффектов в элюент добавляют либо низкомолекулярные нейтральные соли (NaCl, NaNO₃ и др.), либо изменяют рН элюента (растворителя, протекающего сквозь частицы сорбента) в сторону уменьшения диссоциации ионогенных групп (анионных или катионных) в цепях макромолекул. Для реализации эксклюзионного механизма разделения анионных полиэлектролитов, имеющих в цепях карбоксильные или сульфогруппы, в большинстве случаев достаточно использовать элюент с ионной силой 0,1 М моль/л.

Биополимеры находят широкое применение в биомедицине, фармацевтике, косметологии, сельском хозяйстве и других областях благодаря их полезным и уникальным свойствам. К числу биологически активных полисахаридов из природного сырья можно отнести хитозан, каррагинан, галактоманнан, арабиногалактан, гепарин, агар, фукоидан и др. Многие сульфатированные полисахариды обладают разнообразной биологической активностью и имеют иммуномодулирующие, противоопухолевые, противовирусные и антибактериальные свойства [6]. Наиболее широко используемым прямым антикоагулянтным препаратом в современной медицинской практике является природный гликозаминогликан гепарин, который в водных растворах проявляет полиэлектролитное свойство. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов зависит от метода сульфатирования, влияющего на степень сульфатирования, характера и расположения сульфатных групп, молекулярной массы (ММ) [3]. Антикоагулянтной активностью обладают сульфаты хитозана, а также такие растительные полисахариды, как сульфаты пуллулана [6], арабино-галактана [3; 4; 8], галактоманнана (ГМ) [1] и фукоиданы [5]. В литературе имеется ограниченное число работ по определению ММХ биоактивных полисахаридов и уделено недостаточное внимание проявлению электростатических и полиэлектролитных эффектов сульфатов хитозана и гуарового галактоманнана, гепарина, а также карбоксиметилхитозана в зависимости от условия проведения ЭХ.

Цель исследования. Целью исследования является изучение полиэлектролитных свойств биоактивных полисахаридов разного биологического происхождения: гепарина, карбоксиметилхитозана, сульфатированных производных хитозана и гуарового галактоманнана в гель-хроматографическом эксперименте.

Материалы и методы. Для анализа концентрационных зависимостей в качестве пробы гепарина использовали аптечный препарат марки «Гепарин-Индар» от ЧАО по производству инсулинов «Индар» (Украина). Сульфатирование гуарового ГМ Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub (Sigma, США) проводили по методике, описанной в [1]. Сульфат хитозана синтезировали согласно методике, опубликованной в [9], исходным сырьем для которого является хитин из панцырей крабов Средиземного моря. Изучение и анализ полиэлектролитных эффектов проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1260 Infinity (США), снабженном рефрактометрическим детектором с использованием хроматографической колонки TSK GM PW_XL (Tosoh Bioscience LLC, США). Элюентами служили бидистиллированная вода и водный раствор нитрата натрия с концентрацией 0,1 моль/л. Объемная скорость потока элюента составляла 0,5 мл/мин. Для калибровки колонки в качестве полимерных стандартов использовали узкодисперсные стандарты пуллуланов фирмы Polymer Standart Service (г. Майнц, Германия). Обработка результатов анализа проведена с помощью компьютерной программы Windows Chemstation. Объем и концентрация вводимого раствора полимера составляли соответственно 20 мкл и 3 мг/мл.

Результаты и обсуждение

Гепарин широко используется в медицине в качестве антикоагулянта прямого действия. Он является мукополисахаридом, состоящим из сульфатированных остатков D-глюкозамина и D-глюкуроновой кислоты (рис. 1а). В водном растворе гепарин имеет отрицательный заряд за счет ионизации сульфоанионов, что способствует его взаимодействию с белками, которые участвуют в процессе свертывания крови.

Рисунок 1. Химическая структура гепарина (а) и гепарина натрия (б)

Из структуры гепарина натрия можно видеть, что он является сильным анионным полиэлектролитом из-за наличия плотно расположенных сульфатных групп вдоль цепи молекулы (рис. 1б). Для исследования электростатических свойств образцов использовали гидрофильный сорбент TSK GMPW_XL c линейной калибровочной зависимостью в широком диапазоне средних ММ (от 500 до 6×10⁶ Дальтон).

В качества примера на рисунке 2 представлена гель-хроматограмма смеси стандартов пуллуланов с разной ММ в диапазоне от 0,5 до 708 кДа. Данную колонку использовали для снятия концентрационных зависимостей удерживаемых объемов (времени элюции) раствора «Гепарин-Индар», у которого основным компонентом в растворе является гепарин натрия с концентрацией 5,3 мг/мл.

Рисунок 2. Разделение узкодисперсных стандартов пуллулана (PSS, Германия). Значения молекулярных масс у кривых: 1 – 708 кДа; 2 – 107 кДа; 3 – 9,8 кДа; 4 – 0,5 кДа; 5 – пик растворителя. Хроматографическая колонка TSK GM PW_XL размером 25×0,8 см. Элюент: 0,1 М NaNO₃ в воде

На рисунке 3 представлены совмещенные гель-хроматограммы гепарина натрия в растворе, полученные при различных концентрациях вводимой пробы. Видно, что с каждым повышением концентрации гепарина в пробе увеличивается время элюции и профили хроматограмм становятся асимметричными (рис. 3, кривые 1–4), что характерно для эффектов полиэлектролитного набухания и ионной эксклюзии. Схожие эффекты наблюдались также при анализе арабиногалактанов [2] методом ЭХ в воде. Данный эффект объясняется тем, что при движении макромолекул вдоль хроматографической колонки с уменьшением концентрации полимера в растворе не только смещаются максимумы пиков в сторону уменьшения времени элюции, но и передние края хроматограмм сильно удлиняются, а задние претерпевают резкий спад.

Рисунок 3. Совмещенные гель-хроматограммы препарата «Гепарин-Индар», полученные в воде (кривые 1–4). Концентрация гепарина у кривых (в г/л): 1 – 0,5; 2 – 1; 3 – 2; 4 – 5,3, а также в водно-солевом элюенте с содержанием 0,1 М нитрата натрия с разделением гепарина (кривая 5) от низкомолекулярных вспомогательных веществ в его составе (спирт бензиловый, натрия хлорид) (кривая 6)

Данный факт указывает на дополнительное разворачивание цепей полимера при его низких концентрациях в растворе за счет полиэлектролитного набухания, приводящее к асимметрии элюционных кривых. Это связано с тем, что макромолекулы, находящихся в задней части хроматограмм, увеличиваясь в размерах, догоняют молекулы, находящиеся в центральной ее части. В результате профили элюционных кривых становятся асимметричными. Для подавления вышеуказанных электростатических эффектов мы использовали в качестве элюента воду, содержащую 0,1 М NaNO₃. Хроматографические пики 5 и 6 на рис. 3 получены после устранения электростатических эффектов. Видно, что гель-хроматограмма гепарина (кривая 5) становится симметричной и ее максимум смещается в сторону повышения времени удерживания. Это свидетельствует о том, что ионы натрия в растворе экранируют электростатические Кулоновские силы отталкивания, образованные вокруг сульфат-анионов в цепях гепарина, а также ионизованных остаточных гидроксил-анионов на поверхности сорбента. В результате нейтрализуются как внутримолекулярные электростатические взаимодействия гепарина натрия (полиэлектролитное набухание), так и силы отталкивания между макроанионами гепарина и остаточных анионных групп поверхности сорбента (ионная эксклюзия).

С целью изучения полиэлектролитного эффекта в ЭХ анионных полисахаридов были сняты гель-хроматограммы в водном и водно-солевом элюенте карбоксиметилхитозана (КМХ). На рисунке 4 представлены гель-хроматограммы промышленного образца КМХ компании Shandong Yinuokang Pharmaceutical Co., LTD (Китай), зафиксированные в воде (а) и водно-солевом элюенте, содержащем 0,1 моль/л нитрата натрия (б).

Рисунок 4. Гель-хроматограммы промышленного карбоксиметилхитозана (Shandong Yinuokang Pharmaceutical Co., LTD, Китай) в воде (а) и в водно-солевом элюенте (водный раствор 0,1 М NaNO₃) (б)

Как видно из рисунка в воде (рис. 4 а) из-за наличия эффекта полиэлектролитного набухания значение времени элюции (около 9,2 мин), соответствующее максимуму хроматографического пика КМХ, имеет меньшее значение, чем у хроматограммы, полученной в водно-солевом элюенте (рис. 4б), о чем свидетельствует подавление внутримолекулярных электростатических взаимодействий в цепях молекул КМХ. В водно-солевом элюенте реализуется эксклюзионный механизм разделения ЭХ, и форма гель-хроматограммы становится симметричной, и максимум элюционной кривой смещен в сторону увеличения времени удерживания. Здесь следует отметить, что КМХ состоит из двух фракций (см. рис. 4б), различающихся по молекулярной массе.

С целью исследования влияния процесса модификации на ММ сульфатированных полисахаридов в [11] синтезирован сульфат гуарового ГМ (рис. 5) комплексом триоксида серы с 1,4-диоксаном. Изучены влияние температуры, продолжительность синтеза и объем хлорсульфокислоты по степени замещения сульфатов ГМ. Установлены следующие оптимальные условия для сульфатирования гуаровой камеди с комплексом триоксид серы – 1,4-диоксан были установлены: температура – 60 °С, продолжительность – 2,9 ч, объем хлорсульфоновой кислоты – 3,1 мл.

Рисунок 5. Структура сульфатированного гуарового галактоманнана [10]

Наличие сульфатных групп в структуре гуаровой камеди подтверждено данными элементного анализа и FTIR-спектроскопии. Сульфатированный ГМ также был охарактеризован методами рентгеноструктурного анализа, сканирующей электронной микроскопии и ЭХ. В ЭХ в качестве элюента использовали водный раствор 0,2 M NaNO₃ + 0,01 M NaH₂PO₄ (рН 7). Из данных гель-хроматографии показано, что в процессе сульфатирования гуаровой камеди комплексом триоксида серы с 1,4-диоксаном молекулярная масса снижается с 600 до 176 кДа.

Рисунок 6. Гель-хроматограммы гуарового галактоманнана Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub (Sigma, США), полученные в воде (а) и водном растворе 0,1 М NaNO₃ (б)

Проведенные нами гель-хроматографические анализы в водном элюенте показали полиэлектролитную природу сульфатов гуарового ГМ Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub (Sigma, США) (рис. 6). Из рисунка видны мультимодальные профили хроматограмм (рис. 6а), из которых время удерживания первого пика соответствует исключенному объему колонки (V₀ = 8,5 мин). Полиэлектролитный эффект и, соответственно, первый пик исчезает, когда использовали водно-солевой элюент, содержащий 0,1 М NaNO₃ в воде (рис. 6б).

Рисунок 7. Структурная единица сульфата хитозана

Аналогичные результаты нами были получены при хроматографировании сульфатов хитозана, синтезированного из хитина панцырей крабов Средиземного моря (рис. 7).

На рисунке 8 представлены элюционные кривые сульфата хитозана, полученные в водном (а) и водно-солевом элюенте (б). Из рисунка можно видеть, что сульфат хитозана из-за присутствия сульфатных групп у атомов С2, С3 и С6 проявляет полиэлектролитное свойство, что подтверждается уменьшением времени элюции образца до исключенного объема V₀ (V₀ ≈ 8 мин) хроматографической колонки, и при этом профиль хроматограммы становится асимметричным. Сульфоанионы, диссоциированные в воде, в цепях молекул сульфатов хитозана вследствие электростатических отталкиваний способствуют проявлению полиэлектролитного эффекта, и в результате время элюции образца уменьшается. Использование же элюента с ионной силой 0,1 моль/л подавляет полиэлектролитное набухание, о чем свидетелствует увеличение времени элюции образца до значений 13,5 и 14,1 мин (рис. 8б). Как видно из рисунка 8б, образец сульфата хитозана также состоит из двух фракций с ММ 3 кДа и 1 кДа (соответствующие кривые 1 и 2).

Рисунок 8. Гель-хроматограммы сульфатированного хитозана, синтезированного из хитина панцырей крабов Средиземного моря. Элюент: вода (а) и водный раствор 0,1 М NaNO₃ (б). Элюционные кривые у рис. б: 1 и 2 – фракции олигохитозана, 3 – пик растворителя

Выводы. В ЭХ, как установлено из концентрационных зависимостей времени удерживания гепарина, а также из гель-хроматограмм сульфата хитозана, карбоксиметилхитозана и сульфатов галактоманнана в водном элюенте, наблюдаются полиэлектролитные эффекты. Явление полиэлектролитного набухания при хроматографировании указанных биоактивных полисахаридов исключается использованием в качестве эдюента водно-солевого раствора нитрата натрия с концентрацией 0,1 моль/л, и в результате реализуется молекулярно-ситовой механизм разделения ЭХ. Для определения молекулярно-массовых параметров методом ЭХ указанных полимеров рекомендуется использовать элюент, содержащий водный раствор нитрата натрия с концентрацией 0,1 моль/л.

Список литературы:

1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана семян Cyamopsis tetragonoloba / Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. – 2008. – Т. 44, № 1. – С. 111–116.
2. Модификация матрицы арабиногалактана в процессе формирования металлополимерных нанобиокомпозитов / Г.П. Александрова, А.С. Боймирзаев, И.В. Клименков, Б.Г. Сухов // Российские нанотехнологии. – 2019. – Т. 14, № 1–2. – С. 39–46.
3. Способ получения сульфатированных производных арабиногалактана, обладающих антикоагулянтной и гиполипидемической активностью // Патент России № 2532915. 2014. Бюл. № 2 / Костыро Я.А., Станкевич В.К., Трофимов Б.А.
4. Сульфатированные производные арабиногалактана и их антикоагулянтная активность / С.А. Кузнецова, Н.Ю. Васильева, Н.Н. Дрозд, М.А. Михайленко [и др.] // Хим. раст. сырья. – 2019. – № 4. – С. 47–56.
5. A sulfated polysaccharide, fucans, isolated from brown algae Sargassum vulgare with anticoagulant, antithrombotic, antioxidant and anti-inflammatory effects / CMPG Dorea, MGCF Alvesa, LSEP Willa, TG Costa [et al.] // Carbohydr. Polym. – 2012. – Vol. 91, № 1. – P. 467–475.
6. Alban S., Schauerte A., Franz G. Anticoagulant sulfated polysaccharides: Part I. Synthesis and structure – activity relationships of new pullulan sulfates // Carbohydrate Polym. – 2002. – V. 47. – P. 267–276.
7. Boymirzaev A.S., Shomurotov Sh., Turaev A.S. Secondary effects in aqueous size-exclusion chromatography of polysaccharides // Хим. раст. сырья. – 2013. – № 2. – С. 51–55.
8. Sulfation of arabinogalactan with sulfamic acid under homogeneous conditions in dimethylsulfoxide medium / A.V. Levdansky, N.Yu. Vasilyeva, А.А. Kondrasenko, V.A. Levdansky [et al.] // Wood Sci Technol. – 2021. – V. 55, № 6. – P.1725–1744.
9. Synthesis optimization, DFT and physicochemical study of chitosan sulfates / A.S. Kazachenko, F. Akman, Y.N. Malyar, N. Issaoui [et al.] // Journal of Molecular Structure. – 2021. – V. 1245. – P. 131083.
10. Theoretical and experimental study of guar gum sulfation / A.S. Kazachenko, F. Akman, A. Sagaama, N. Issaoui [et al.] // Journal of Molecular Modeling. – 2021, V. 27, № 5. – P. 1–15.