ИССЛЕДОВАНИЕ ФОСФАТСОЛЮБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ГРАНУЛЫ ФОСФОРНЫХ МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ

АННОТАЦИЯ

Исследованы возможности использования фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов для улучшения усвояемости фосфорных минеральных удобрений. Установлено, что аборигенные микроорганизмы на минеральных удобрениях «Аммофос», PS-Agro, «Супрефос-NS» и фосфогипсе до и после стерилизации отсутствуют. Установлено, что в иммобилизованном состоянии на гранулах минеральных удобрений клетки фосфатсолюбилизирущего штамма Bacillus subtilis BS-26 не теряют свою фосфатсолюбилизирущую активность по сравнению со свободными клетками. При этом иммобилизованные клетки штамма на гранулах удобрения «Аммофос» наиболее активно освобождали Р₂О₅ (78,0–82,0 мг Р₂О₅/100 мл) из Са₃(РО₄)₂, чем на других минеральных удобрениях. Высвобождение Р₂О₅ иммобилизованными клетками штамма составили: на гранулах «Супрефоса» – 73,0–76,0 мг Р₂О₅/100 мл; на PS-Agro – 70,0–73,0 мг Р₂О₅/100 мл; на фосфогипсе – 60,0–64,0 мг Р₂О₅/100 мл и свободными клетками – до 66,0–68,0 мг Р₂О₅/100 мл соответственно на 3–5-е сутки опыта.

ABSTRACT

The possibilities of using phosphate-solubilizing microorganisms to improve the digestibility of phosphate mineral fertilizers have been studied. It has been established that there are no native microorganisms on mineral fertilizers Ammophos, PS-Agro, Suprefos-NS and phosphogypsum before and after sterilization. It is revealed that, in the immobilized state on mineral fertilizer granules, the cells of the phosphate-solubilizing strain Bacillus subtilis BS-26 do not lose their phosphate-solubilizing activity, compared to free cells. At the same time, immobilized cells of the strain on Ammophos fertilizer granules most actively released P₂O₅ (78.0–82.0 mg P₂O₅/100 ml) from Ca₃(PO₄)₂ than on other mineral fertilizers. The release of P₂O₅ by the immobilized cells of the strain was: on Suprefos granules – 73.0–76.0 mg P₂O₅/100 ml; on PS-Agro – 70.0-73.0 mg P₂O₅/100 ml; on phosphogypsum 60.0–64.0 mg P₂O₅/100 ml and free cells – up to 66.0–68.0 mg P₂O₅/100 ml, respectively, on the 3rd-5th day of the experiment.

Ключевые слова: иммобилизация, фосфатсолюбилизирующие микроорганизмы, Bacillus subtilis BS-26, фосфорные удобрения.

Keywords: immobilization, phosphate-solubilizing microorganisms, Bacillus subtilis BS-26, phosphate fertilizers.

Введение

Фосфор является основным лимитирующим элементом, входит в состав основных органоидов клеток растений, является неотъемлемой частью нуклеиновых кислот и многих ферментов, регулирующих биохимические процессы растительных и животных организмов [5; 7].

В щелочных карбонатных почвах фосфор переходит в нерастворимый Са₃(РО₄)₂, а затем – апатит. Чем больше изучается фиксация соединений фосфора в почвах, тем более делается ясным, что пахотный и корнеобитаемый горизонты почвы способны поглощать, дезактивировать и задерживать от последующего выщелачивания неограниченные количества фосфора [8]. Фиксация фосфатов почвами бывает иногда настолько полной и необратимой, что даже раствор 0,2–0,5 н HCl не извлекает весь связанный фосфор [9].

Многочисленными научными исследованиями установлено, что многие микроорганизмы, такие как Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Mycobacterium, Penicillium, Aspergillus и т.д., могут переводить нерастворимые соединения фосфорной кислоты в растворимое состояние в результате образования ими углекислого газа или различных кислот и ферментов [1; 10].

В некоторых случаях растворению фосфатов способствуют азотная кислота, образуемая нитрифицирующими бактериями, и серная кислота, появляющаяся в результате деятельности бактерий, окисляющих серу. Все это повышает доступность фосфора для растений [1; 6; 10].

Наряду с традиционными способами применения микробиологических биопрепаратов способ иммобилизации в гранулы минеральных удобрений микроорганизмов представляет особый интерес для сельскохозяйственного производства, поскольку способ позволяет существенно снижать нормы расхода удобрения, повышает КПД и эффективность препарата за счет рационального использования питательных веществ удобрения и мобилизации закрепленных запасов минеральных элементов почвы.

Цель работы: изучение возможности использования фосфатсолюбилизирующих микроорганизмов в производстве минеральных удобрений для повышения их усвояемости, а также для активации труднодоступных фосфатных запасов почвы.

Объекты исследования

Объектами исследований являлись биомодифицированные на основе фосфатсолюбилизирущего штамма бактерии Bacillus subtilis BS-26, фосфорные минеральные удобрения «Аммофос», PS-Agro, «Супрефос-NS» и фосфогипс.

Методы исследования

Естественная микрофлора фосфорных минеральных удобрений «Аммофос», PS-Agro и «Супрефос-NS» исследовали до и после стерилизации. При этом учитывались такие группы микроорганизмов, как аммонификаторы на среде РПА, грибы и актиномицеты на среде Чапека и олигонитрофилы на среде Эшби. Расчет числа бактерий, грибов и актиномицетов вели на 1 г воздушно-сухого носителя по формуле:

где  а – количество клеток в 1 г носителя;

б – среднее количество колоний на чашке;

в – разведение, из которого сделан посев;

г – количество капель в 1 мл суспензии;

д – вес воздушно-сухого носителя, взятого для анализа [3].

Стерилизацию удобрений провели в автоклаве при 1 атм. в течение 1 часа. Иммобилизацию клеток фосфатсолюбилизирующего штамма Bacillus subtilis BS-26 в гранулы фосфорных удобрений осуществляли методом адсорбционной иммобилизации. После высушивания готовый сухой препарат в закрытом виде хранили при комнатной температуре [4].

Фосфатсолюбизирующую активность иммобилизованных в гранулы удобрений клеток штамма Bacillus subtilis BS-26 определяли при росте бактерий в жидкой питательной среде NBRIP. Для этого 10 г образца опытных удобрений растворяли в 90 мл дистиллированной воды и перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут для полного отделения микроорганизмов от удобрения. После отстаивания в течение 20 минут стерильной пипеткой 1 мл суспензии добавляли в среду NBRIP, содержащую нерастворимый Ca₃(PO₄)₂ следующего состава: глюкоза – 10; MgCl₂•6H₂O – 5; MgSO₄•7H₂O – 0,25; KCl – 0,2; (NH₄)₂SO₄ – 0,1; неорганический фосфат Ca₃(PO₄)₂ – 5; вода водопроводная – 1000 мл; pH 7,0. Затем колбы помещали на шейкере при 37 °С и 200 об/мин. В качестве контроля использовали культуру свободных (без минеральных удобрений) клеток штамма Bacillus subtilis BS-26, хранившихся на скошенном агаре при температуре 4–5 °С, с периодическими пересевами. Через 1, 2 и 3 суток культуру бактерий центрифугировали, отбирали супернатант, в котором по методу Чирикова определяли содержание подвижных форм фосфора, растворимых в 0,5 М уксусной кислоты [2].

Результаты исследований и обсуждение

Исследование численности различных физиологических групп микроорганизмов на отечественных фосфорных минеральных удобрениях «Аммофос», PS-Agro, «Супрефос-NS» и фосфогипсе до и после стерилизации провели следующим образом: общее количество аммонификаторов, растущих на среде МПА, количество микромицетов и актиномицетов на среде Чапека, количество олигонитрофилов на среде Эшби, фосфатсолюбилизирующих на среде Пиковской с трикальцийфосфатом. Результаты опыта показали, что во всех изученных видах минеральных удобрений и фосфогипсе не было обнаружено посторонней микрофлоры.

Анализ результатов экспериментов по изучению фосфатсолюбилизирующей активности иммобилизованных на минеральных удобрениях «Аммофос», PS-Agro, «Супрефос-NS» и фосфогипсе клеток Bacillus subtilis BS-26 показал, что иммобилизованные клетки бактерий проявили лучшие данные по растворению Са₃(РО₄)₂ по сравнению со свободными (без минеральных удобрений) клетками, хранившимися на скошенном агаре при температуре 4–5 °С с периодическими пересевами (рис. 1).

Рисунок 1. Мобилизация Р₂О₅ из Са₃(РО₄)₂ свободными (СВ) и иммобилизованными (ИМ) в гранулы удобрений клетками штамма Bacillus subtilis BS-26

На первые сутки опыта наиболее активную мобилизацию Р₂О₅ из Са₃(РО₄)₂ показали клетки, иммобилизованные на «Аммофосе» – 63,0 мг Р₂О₅/100 мл из Са₃(РО₄)₂, тогда как свободные клетки освобождали до 53,0 мг Р₂О₅/100 мл. При этом наименьшую активность проявили иммобилизованные клетки на фосфогипсе – 50 мг/100 мл. На 3-е и 5-е сутки такая тенденция сохранялись, при этом на протяжении всего опыта наиболее высокую активность по растворению Са₃(РО₄)₂ проявили клетки фосфатсолюбилизирущего штамма, иммобилизованные на гранулах удобрения «Аммофос», освобождая 78,0–82,0 мг Р₂О₅/100 мл на 3-е и 5-е сутки опыта, а иммобилизованные на «Супрефосе» – до 73,0–76,0 мг Р₂О₅/100 мл, иммобилизованные на PS-Agro клетки – до 70,0–73,0 мг Р₂О₅/100 мл. Свободные клетки растворяли до 66,0–68,0 мг Р₂О₅/100 мл соответственно. Среди опытных вариантов наименьшую активность по растворению трикальцийфосфата проявили клетки бактерии, иммобилизованные на фосфогипсе – 60,0–64,0 мг Р₂О₅/100 мл.

Выводы

Таким образом, исследование численности различных физиологических групп микроорганизмов на отечественных фосфорных минеральных удобрениях «Аммофос», PS-Agro, «Супрефос-NS» и фосфогипсе до и после стерилизации показало, что во всех изученных видах минеральных удобрений и фосфогипсе не обнаружено посторонней микрофлоры. Результаты экспериментов по фосфатсолюбизирующей активности иммобилизованных в гранулы удобрений клеток штамма Bacillus subtilis BS-26 показали, что в иммобилизованном состоянии на гранулах минеральных удобрений клетки фосфатсолюбилизирующего штамма не теряют свою фосфатсолюбилизирущую активность по сравнению со свободными клетками. При этом иммобилизованные на гранулах удобрения «Аммофос» клетки фосфатсолюбилизирущего штамма наиболее активно освобождали Р₂О₅ (78,0–82,0 мг Р₂О₅/100 мл) из Са₃(РО₄)₂, чем на других минеральных удобрениях. Видимо, это связано с тем, что минеральное удобрение «Аммофос» содержит в большом количестве фосфор (45,3%) и элемент N по сравнению с другими минеральными удобрениями, что благотворно влияет на фосфатсолюбилизирующую активность штамма.

Список литературы:

1. Биологизация минеральных удобрений как способ повышения эффективности их использования / А.А. Завалин, В.К. Чеботарь, А.Г. Ариткин, Д.Б. Сметов // Достижения науки и техники АПК. – 2012. – № 9. – С. 45–47.
2. ГОСТ 26204-91. Почвы. Определение подвижных соединений фосфора и калия по методу Чирикова в модификации ЦИНАО. – М. : Изд-во стандартов, 1992.
3. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. – М., 1991. – 350 с.
4. Курдиш И.К. Гранулированные микробные препараты для растениеводства. Наука и практика. – Киев, 2001. – 142 с.
5. Чеботарь В.К., Завалин А.А., Ариткин А.Г. Применение биомодифицированных минеральных удобрений : монография. – М. : ВНИИА; Ульяновск : УлГУ, 2014. – 142 с.
6. A study of organic acid production in contrasts between two phosphate-solubilizing fungi: Penicillium oxalicum and Aspergillus niger / L. Zhen, T. Bai, L. Dai, F. Wang [et al.] // Sci. Rep. – 2016. – № 6. – P. 25313.
7. Alori E.T., Glick B.R., Babalola O.O. Microbial phosphorus solubilization and its potential for use in sustainable agriculture // Front. Microbiol. – 2017. – № 8. – P. 971.
8. Phosphorus acquisition efficiency in arbuscular mycorrhizal maize is correlated with the abundance of root-external hyphae and the accumulation of transcripts encoding PHT1 phosphate transporters / R.J.H. Sawers, S.F. Svane, C. Quan, M. Grшnlund [et al.] // New Phytol. – 2017. – № 214. – P. 632–643.
9. Effect of organic acids production and bacterial community on the possible mechanism of phosphorus solubilization during composting with enriched phosphate solubilizing bacteria inoculation / Y. Wei, Y. Zhao, M. Shi, Z. Cao [et al.] // Biores. Technol. – 2018. – № 247. – P. 190–199.
10. Long-term nitrogen fertilization decreased the abundance of inorganic phosphate solubilizing bacteria in an alkaline soil / B.X. Zheng, X.L. Hao, K. Ding, J.B. Zhang [et al.] // Sci. Rep. – 2017. – № 7. – P. 42284.