ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АРАЛЬСКОГО ШТАММА Dunaliella salina AR-1 НА ОТКРЫТОМ ВОЗДУХЕ

АННОТАЦИЯ

В работе исследована возможность культивирования Аральского штамма микроводросли Dunaliella salina AR-1, выделенного из гиперсолёных озёр Приаралья, в лотках под открытым небом с целью получения биомассы богатых бета-каротинами. Показано, что для исключения контаминации культуры посторонними микроорганизмами культивирование следует проводить в среде с общей концентрацией соли 240 г/л. В работе отработан метод двухстадийного культивирования D. salina AR-1: для накопления зелёной биомассы в лотках с толщиной культуральной среды 30 см, и для накопления каротинов в лотках с толщиной культуральной среды 5 см. В результате удаётся получить биомассу с содержанием каротинов более 3% от сухой массы.

ABSTRACT

The possibility of cultivating the Aral microalgae Dunaliella salina AR-1 strain, isolated from the hypersaline lakes of the Aral Sea region, in open-air trays in order to obtain biomass rich in beta-carotenes was studied in this work. It has been shown that in order to exclude contamination of the culture with foreign microorganisms, cultivation should be carried out in a medium with a total salt concentration of 240 g/L. In this work, a method of two-stage cultivation of D. salina AR-1 was developed: for the accumulation of green biomass in trays with a culture medium thickness of 30 cm, and for the accumulation of carotenes in trays with a culture medium thickness of 5 cm. As a result, it is possible to obtain biomass with a carotene content of more than 3% from dry weight.

Ключевые слова: Dunaliella salina, β-каротин, пальмеллы, биогенные элементы, галофиллы.

Ключевые слова: Dunaliella salina, β-каротин, пальмеллы, биогенные элементы, галофиллы.

Введение. Из гиперсолёных озёр Приаралья в Институте микробиологии АН РУз был выделен и охарактеризован аральский штамм микроводоросли Dunaliella salina AR-1, который содержит большие количества биологически активных веществ (БАВ): каротина, витаминов, эссенциальных липидов [1]. Из-за этих БАВ Dunaliella salina является объектом промышленного культивирования в некоторых южных странах: Австралии, Индии, Китае, США и др. [2]. Недостаток этих БАВ имеется и в Узбекистане. Поэтому, возникает вопрос о необходимости промышленного культивирования Аральского штамма Dunaliella salina AR-1 в климатических условиях Узбекистана. Для этого необходимо изучить условия культивирования Dunaliella salina AR-1 на открытом воздухе.

Целью работы явилось изучение условий культивирования Dunaliella salina AR-1 на открытом воздухе с целью получения богатой каротинами биомассы.

Материалы и методы. Объект исследования – зеленая галофильная микроводросль Dunaliella salina AR-1 из коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

В работе водоросли культивировали в питательной среде, содержащей NaCl – 120 или 200 г/л, MgSO₄ 7H₂O - 50 г/л, KNO₃ - 2,5 г/л, K₂HPO_{4 4} - 0,2 г/л, NaHCO_{3 -} 1.0 г/л и следовые количества микроэлементов (Fe, Mg, Zn, Mo, V, Mn, Se, I), для приготовления которой использовали водопроводную воду.

Для культивирования использовали композитные пластмассовые прямоугольные (100 х 200 х 20 см) и круглые (диаметром 200 см и высотой 50 см) лотки объёмом 200 л и 1000 л соответственно (рис.1). Культуру барботировали воздухом. Освещённость на Солнце достигала 50 кЛк.

Рисунок 1. Культивирование микроводоросли Dunaliella salina AR-1 на открытом воздухе

Концентрацию микроводорослей определяли тремя методами: 1 - микроскопическим подсчетом клеток в камере Горяева (млн. клеток/мл), 2 - взвешиванием высушенных нитроцеллюлозных фильтров диаметром 5 см и размером пор 0,45 мкм до и после фильтрования через них 10 мл суспензии микроводорослей и 3 - измерением оптической плотности суспензии на электрическом фотоколориметре KF-77 Zalimp (Польша). На основании этих трёх методов получали калибровочные графики зависимости оптической плотности от количества клеток и биомассы в 1 мл. В дальнейшем использовали наиболее быстрый и простой метод измерения оптической плотности. В работе использовали микроскоп Leica IM c камерой Leica DFC-280.

Биомассу микроводорослей из небольших объёмов (1-2 л) среды собирали центрифугированием 15 мин при 5000 g на центрифуге РС-6 (Россия), а из больших объёмов (до 1000 л) среды с помощью молочного сепаратора «Сокол-MS-100», ООО «МАП Юнион» (Россия). Пропустив через сепаратор 10 – 30 л суспензии (в зависимости от концентрации биомассы), барабан снимали, разбирали и выскабливали пастообразную биомассу с крышки барабана и тарелок, т.е. там, где обычно собирается мусор из молока. Биомассу высушивали лиофильно.

Общие каротиноиды и хлорофиллы в сухой биомассе определяли в ацетоновых экстрактах спектрофотометрически по специфическому поглощению каротиноидов при 470 нм, хлорофиллов а (662 нм) и b (645 нм) [3].

Результаты и их обсуждение. В лаборатории чистую культуру D.salina AR-1 культивировали в среде Артари с общей концентрацией солей 140 г/л. При культивировании микроводорослей под открытым небом стерильность культуры поддерживать невозможно, она контаминируется неспособными накапливать каротины Dunaliella minuta, различными диатомовыми, цианобактериями и хищными простейшими. Особенно вредными оказываются эти шарообразные жгутиковые простейшие размером около 30 мкм, которые вращаясь засасывают в свой рот различные микроорганизмы размером до 10 мкм.

Чтобы избавиться от посторонних микроорганизмов концентрацию NaCl повысили до 200 г/л, при этом с учётом 50 г/л MgSO₄ 7H₂O, общая концентрация солей стала около 225 г/л. При этой концентрации солей посторонние микроорганизмы практически не развиваются и штамм D. salina AR-1 остаётся относительно чистым. 

По данным литературы D.salina лучше размножается вегетативным делением в «зелёной форме», то есть при умеренном освещении 5 – 10 клк (90 – 180 µMol (photons) s^-1m^-2), концентрации солей 140 г/л, оптимальных концентрациях биогенных элементов (N, K, P), рН 8-9, барботировании воздухом, и температуре 20-25°С [4]. Однако, в «зелёной форме» содержание наиболее ценных коммерческих продуктов – каротиноидов в D. salina AR-1 около 0,45% [1], т.е. приблизительно столько же, сколько в других промышленно значимых микроводорослях: хлорелле (0,16%), спируллине (0,6%) и листьях различных растений (0,05-0,3%). Эти каротиноиды принимают участие в фотосинтезе и содержатся в хлоропластах.

При стрессовых условиях культивирования: освещённости выше 20 клк, концентрации солей выше 240 г/л, недостатке биогенных элементов, температуре выше или ниже оптимальных, в D.salina начинают накапливаться каротиноиды в липидных гранулах вблизи плазматической мембраны. И таким образом, содержание каротиноидов в жёлтых движущихся клетках D.salina может повысится до 3,0%. а если D.salina образует цисты, то до и 12% от сухой биомассы [4].

В связи с этим, для получения обогащённой каротиноидами биомассы D.salina разработаны методы её культивирования в два этапа [2]. На первом этапе создают условия для максимального наращивания зелёной биомассы, и на втором, создают стрессовые условия для максимального накопления каротиноидов.

Для культивирования D. salina AR-1 на открытом воздухе в зелёной форме были использованы лотки с толщиной слоя культуральной среды около 30 см, при оптимальных концентрациях биогенных элементов (N, K, P) и барботировании воздухом. При такой толщине культуральной среды подвижные клетки D. salina AR-1 сами выбирали себе глубину с оптимальной освещённостью для размножения и развития. В наших измерениях при концентрации клеток D. salina AR-1 около 2 млн/мл (1 г/л) при освещённости на поверхности среды около 50 клк, на глубине 10 см освещённость была уже около 5 клк. При этом, температура среды за счёт испарения воды не повышалась выше 35°С, даже в наиболее жаркий период, когда в тени температура повышалась до 45°С, а на Солнце выше 60°С.

При этих условиях D. salina AR-1 размножается через пальмеллы. Взрослые клетки размером 10-15 мкм покрываются слизью, опускаются на дно и в этих слизистых мешках делятся на большое количество (до 30) маленьких (около 1 мкм) клеток, которые выходят из пальмелл и растут до взрослого состояния и затем снова образуют пальмеллы.

Был использован метод накопительного культивирования, при котором при замедлении роста биомассы добавляли расходуемые биогенные элементы (КNO₃, K₂HPO₄) до исходных концентраций. На рисунке 2. представлена динамика роста биомассы при этом культивировании за 40 дней.

На дне лотка образуется бело-серый слой из пустых оболочек пальмелл, состоящий из полисахаридов. Из этого слоя продолжают выходить маленькие (меньше 1 мкм) бесцветные клетки, которые растут, зеленеют и вырастают до взрослых зелёных особей.

Рисунок 2. Динамика изменения концентрации биомассы D.salina AR-1 от времени культивирования в среде с общей солёностью 240 г/л при максимуме солнечной освещённости в середине дня 50 кЛк (900 µMol (photons) s^-1m^-2), при барботировании воздухом (5 л/мин.). Стрелками показано добавление концентрата биогенных элементов

Для стимуляции каротиногенеза, из круглого лотка объёмом 1000 л, перед добавлением биогенных элементов, брали 50 л суспензии микроводорослей и переносили в прямоугольный лоток с толщиной культуральной среды 5 см. В этом лотке смесь перемешивали лопастной мешалкой. Без перемешивания, сверху образовывалась корочка соли и внутри культуральная среда нагревалась на Солнце выше 60°С. Клетки дуналиеллы при такой температуре разрушались.

С перемешиванием среда не нагревалась выше 42°С и при освещённости около 50 клк, двигающиеся клетки дуналиеллы за 3-4 дня накапливала каротинов до 2,0% от сухой биомассы и становились двигающимися жёлтыми. Далее они теряли способность к движению и превращались в красные цисты (рис. 3). При этом концентрация каротиноидов увеличивалась до 3,0% и выше.

Рисунок 3. Микроводоросль D.salina AR-1 в трёх формах: зелёной, жёлтой и цист

При этом культура D.salina AR-1 не была чистой. Она содержала Dunaliella minuta не способную накапливать каротиноиды и различные бактерии. Но для цели получения биомассы богатой каротиноидами этот результат можно считать удовлетворительным.

Далее возникает проблема сбора биомассы дуналиеллы. Характерной особенностью дуналиеллы является то, что благодаря легкой проницаемости плазматической мембраны для воды и некоторых ионов она быстро уравновешивает внутреннее осмотическое давление с внешним [4]. Таким образом плотность внутреннего содержимого клеток дуналиеллы становится равной плотности внешней среды, из-за чего её трудно бывает осадить полностью центрифугированием или сепарированием. Если непосредственно перед сепарированием разбавить культуральную среду на 20% водой, то можно собрать до 80% крупных клеток дуналиеллы.

Таким образом, в нашей работе, при культивировании D.salina AR-1 в лотках под открытым небом, показана принципиальная возможность искусственного культивирования D.salina AR-1 в условиях климата Узбекистана.

Список литературы:

1. Верушкина О.А., Баймурзаев Э.Н., Тонких А.К. Аральский штамм микроводоросли Dunaliella salina AR-1 как источник биологически активных веществ//Universum: химия и биология: эленктрон. научн. журн. 2022. 5(95)
2. Ben-Amotz A. Industrial Production of Microalgal Cell-mass and Secondary Products – Major Industrial Species Dunaliella.// in Handbook of microalgal Culture. Biotechnology and Applied Phycology. Ed. by Amos Richmond. Blackwell Science LTD. 2004. P. 273-280.
3. Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R., Determination of Total Carotenoids and Chlorophylls A and B of Leaf in Different Solvents, Biochemical Society Transactions., 1985. V.11, pp. 591-592
4. Масюк Н.П. 1973. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. – Киев: Наукова думка, - 244 c.