ВЛИЯНИЕ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И КОЛИЧЕСТВО ИНОКУЛЯТА Aspergillus niger

АННОТАЦИЯ

Показано, что степень радиочувствительности природного штамма Aspergillus niger 8 – продуцента лимонной кислоты, находится в прямой зависимости от количества конидий в инокуляте. Выявлено, что при исходном количестве конидий мицелия 2,5x10⁵, и воздействии γ-облучением в дозе выше 3 кГр наблюдается ингибирование роста и развития штамма. В то время как, при исходном количестве конидий 7,0x10⁵ и воздействии γ-облучением в дозе выше 10 кГр наблюдается летальный исход гриба. После процесса облучения в дозах 2-10 кГр всего было выделено 348 мутантных изолятов. Первичный скрининг по кислотообразующей способности штаммов показал, что после воздействия γ-облучением в дозе 2 кГр у двух изолятов зона растворения CaCO₃ вокруг колоний значительно превышала зоны исходного штамма. Установлено, что количество конидий в инокуляте, подвергнутое облучению, влияет на выживаемость гриба и зависит от дозы облучения.

ABSTRACT

The degree of radiosensitivity of the wild type strain of Aspergillus niger 8, a producer of citric acid, which is directly dependent on the number of conidia in the inoculums has been shown. It was revealed that with an initial number of conidia 2.5х10⁵ and exposure to gamma radiation at a dose higher 3 kGy, inhibition of the growth and development of the strain is observed. While, with an initial number of conidia 7.0х10⁵ and exposure to gamma radiation at a dose higher 10 kGy, a lethal outcome of the fungus is observed. After the irradiation process at doses of 2-10 kGy, 348 mutant isolates were totally isolated. A preliminary screening by acid formation ability showed that in two isolates after exposure to gamma irradiation at the dose of 2 kGy resulted for the CaCO₃ dissolution zones around the colonies significantly exceeding the zones of the wild type strain. It was established that the amount of conidia in the irradiated inoculum affects the survival of the fungus and depends on the radiation doses.

Ключевые слова: мутагенез, гамма облучения, доза облучения, А. niger, количество конидий, выделение, выживаемость, лимонная кислота.

Keywords: mutagenesis, gamma radiation, irradiation dose, A. niger, survival, number of conidia, isolation, citric acid.

Открытие рентгеновских лучей и явления радиоактивности способствовали созданию совершенно новых направлений в науке, военной и промышленной сферах, энергетике, медицине, биологии, сельском хозяйстве и прочих отраслях народного хозяйства [1. с. 78]. Все микроорганизмы по чувствительности к излучениям могут быть расположены в следующем порядке. Наиболее чувствительны бактерии, затем следуют, плесневые грибы, дрожжи, споры бактерий и, наконец, вирусы. Однако, такое распределение следует считать условным, ввиду того, что среди бактерий существуют виды, значительно более устойчивые к воздействию ионизирующей радиации, чем споры или вирусы. Известно, что, радиорезистентность обеспечивается клеточными механизмами, которые подразделяются на 2 большие группы. К первой группе относятся такие системы, которые предотвращают образование повреждений в клетках. Вторая группа включает механизмы, восстанавливающие (репарирующие) повреждения в ДНК, вызванные облучением [2.с. 44, 3. с. 2]. Реакции грибов на гамма-излучение изучали в отдельных культурах и инактивация жизнеспособности Alternaria alternata, Aspergillus flavus наблюдалось в диапазонах 1,0–2,0 кГр, для Trichoderma viride, Curvularia geniculata составило 0,5–1,0 кГр. Полное ингибирование роста и развития их наблюдалось при <2,5 кГр [4. с. 1099]. Авторами Tiryaki и Maden показано, что низкие дозы облучения 1 кГр стимулировали развитие мицелиальных грибов Penicillium expansum как in vitro, так и in vivo на плодах груш сорта Анкары [5. с. 10]. Обнаружено, что смертельные дозы облучения, необходимые для патогенов в организме хозяина, выше, чем в культуральной среде [6. с. 422]. Облучение выше 10,0 кГр полностью ингибировало рост Cryptococcus laurentii, Hansenula holstii, Absedia sp. и Aspergillus fumigates, микроорганизмы были выделены из муниципальной станции очистки сточных вод Аль-Ахса (Королевство Саудовская Аравия). Однако, высокая доза облучения 25,0 кГр не проявляла ингибирующего действия на рост дрожжей Candida sake [7. с .98]. Анализ литературных данных показывает, что реакция мицелиальных грибов на γ-облучение различны, и на степень радиочувствительности микроорганизмов влияет множество факторов. В то же время исследования, по изучению влияния количества или плотности мицелия в инокуляте подвергнутом облучению очень мало, и затрудняет характеризовать представленные исследования авторами в сравнительном аспекте.

Мицелиальный гриб Aspergillus niger является наиболее часто используемым микроорганизмом для производства лимонной кислоты. Известно, что высокая продукция лимонной кислоты в значительной степени зависит от используемого штамма [8. с. 85, 9. с. 26, 10. с.714].

В связи с этим целью работы являлось исследование влияния γ-облучения в различных дозах на выживаемость природного штамма A. niger 8 – продуцента лимонной кислоты, изучение влияния исходного количества инокулята на выживаемость штамма, определение оптимальной дозы γ-облучения влияющего на кислотообразующую способность штамма.

Объектом исследования служил природный штамм Aspergillus niger 8 продуцент лимонной кислоты, выделенный из почв Сурхандарьинской области. Культуру выращивали на плотной модифицированной среде Чапека – Докса (ЧМ) следующего состава (г/л): NH₄NO₃ - 2,0; K₂HPO₄ – 1,0; MgSO₄*7H₂O – 0,5; KCl – 0,5; FeSO₄*7H₂O – 0,01; сахарозу – 30,0; агар – 15,0; вода дистиллированная 1000 мл, микроэлементы по Бурхолдеру (мг/л): KJ – 0.1, B – 0.01, Mn²⁺ – 0.01, Zn²⁺ – 0.03, Cu²⁺ – 0.01, Mo²⁺ – 0.01, однако Fe²⁺ входившее в состав микроэлиментов по Бурхолдеру было исключено, так как оно содержалось в основной среде. Конидий гриба, выращенные на плотной среде, смывали физиологическим раствором через 7 суток культивирования при 28 ^оС. Подсчет конидий проводили как на камере Горяева, так и методом серийных десятикратных разведений для установления определенного количества инокулята [11.  с.119]. Полученную суспензию конидий мицелия в количестве 2,5х10⁵ и 7,0х10⁵ конидий/мл разливали по 4 мл в стерильные флаконы объёмами 20 мл в трех повторностях (на каждую дозу) и подвергали облучению. Облучение микробного материала проводили с использованием установки для облучения ⁶⁰Co в Институте ядерной физики АН Республики Узбекистан. На суспензии конидии гриба воздействовали различными дозами γ-облучения с мощностью экспозиционной дозы 0,05 Гр/с междозовый интервал 20, 15, 10, 5, 4, 3 и 2 кГр. Степень инактивации γ -облученных конидий гриба определяли высевом их на твердую среду ЧМ с добавлением 1 г/л пептона, учет наличия или отсутствия роста и его интенсивность вели в течение 7 суток. Для определения кислотообразования, выросшие колонии мицелия высевали уколом на селективную твердую среду с CaCO₃ [12. с.97]. Инкубацию проводили в течение 6 суток в термостате при 28 ^оС.

Результаты исследования показали, что степень радиочувствительности микромицета находится в прямой зависимости от плотности конидий в инокуляте. Зависимость выживаемости природного штамма продуцента лимонной кислоты A. niger 8 от дозы облучения и от плотности численности конидий мицелия представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Зависимость выживаемости гриба A. niger 8 от различной дозы γ-облучения и количества конидий в инокуляте

Из таблицы видно, что при исходном количестве конидий мицелия 2,5х10⁵ и дозе облучения выше 3 кГр наблюдается полное ингибирование роста и развития культуры. При воздействии дозой облучения 3 кГр выживаемость составила 0,0012 %. В то время как, при исходном количестве конидий мицелия 7,0х10⁵ летальная доза наблюдалась при дозе облучения выше 10 кГр. Следует отметить, что при дозе 10 кГр наблюдались единичные колонии. При микроскопировании выросших колоний после облучения в морфологии мицелия изолятов по сравнению с исходным штаммом отличительных изменений не обнаружено. Известно, что гамма-излучение вызывает разрушение и, в конечном счете, летальный исход микроорганизмов происходит по двум механизмам действия: сначала прямым действием образование свободных радикалов за счет энергии ионизации, а во-вторых, вызывая прямое нарушение последовательность нити ДНК, которая приводит к повреждению нуклеотидной последовательности или их участков [13. с.120]. О полном ингибировании роста грибов также сообщили Smith и Pillai [14. с.50], которые обнаружили, что гамма облучение разрушает структуру ДНК клеток, и клетки не могут продолжать свою функцию, в то время как неполное ингибирование может быть результатом незначительного повреждения клеток.

После проведения γ-облучения каждую выросшую колонию высевали на селективную твердую среду для предварительной оценки кислотообразования. Всего после воздействия γ-облучением было выделено 348 колоний мутантных изолятов. В таблице 2 представлена сравнительная характеристика размеры зоны растворения CaCO₃ вокруг колонии природным штаммом A. niger 8 и полученными мутантными вариантами. Обнаружено, что после воздействия γ-облучением в дозе 2 кГр только у двух мутантных изолятов под номерами 8/57 и 8/99 зоны растворения CaCO₃ вокруг колонии значительно превышал по сравнению с исходным штаммом, и составило у обоих изолатов 8 мм. По данным Конюхова Г.В. и др. устойчивость к радиационному облучению, или радиорезистентность, микроорганизмов формируется благодаря возможности клетки регенерировать полученные радиационные повреждения [15]. Следует отметить, что данные мутанты были выделены при использовании конидий гриба в количестве 7,0х10⁵. Однако, у мутантных изолятов выделенных после воздействия γ-облучением в дозе 3, 4, 5 и 10 кГр размеры зоны растворения CaCO₃ вокруг колоний была ниже по сравнению с исходным штаммом.

По-видимому, низкие дозы облучения 2 кГр способствовали увеличению кислотообразования у некоторых выделенных изолятов. Это говорит о том, что только у некоторых конидий гриба в аналогичных условиях облучения, может проявляться радиорезистентность. Полученные данные подтверждают, что радиорезистентность проявляется, благодаря возможности конидий регенерировать полученные радиационные повреждения.

Таким образом, степень радиочувствительности природного штамма Aspergillus niger 8 – продуцента лимонной кислоты, находится в прямой зависимости от количества конидий в инокуляте. Выявлено, что при исходном количестве конидий мицелия 2,5х10⁵, и воздействии γ-облучением в дозе выше 3 кГр наблюдается ингибирование роста и развития штамма. В то время как, при исходном количестве конидий 7,0х10⁵ и воздействии γ-облучением в дозе выше 10 кГр наблюдается летальный исход гриба. После процесса облучения в дозах 2-10 кГр всего было выделено 348 мутантных изолятов. Предварительная оценка кислотообразования показало, что после воздействия γ-облучением в дозе 2 кГр у двух изолятов зона растворения CaCO₃ вокруг колонии значительно превышала зоны растворения исходного штамма. Установлено, что количество конидий в инокуляте, подвергнутом облучению, влияет на выживаемость гриба и зависит от дозы облучения.

Таблица 2.

Кислотообразующая способность природного штамма A. niger 8 и мутантных изолятов на твердой среде содержащей CaCO₃

Список литературы:

1. Алексахин Р.М. Проблемы радиоэкологии: Эволюция идей. Итоги / Р.М. Алексахин. – М.:Рос - сельсхозакадемия,  - 2006.  – 78 с.
2. Патент РФ № 2682712 С1, МПК А61К 35/74, А61К 39/085, А61Р 43/00 Способ лечения радиационных поражений организма / Т.Р. Гайнутдинов, Р.Н. Низамов, В.П. Шашкаров, А.И. Никитин, А.М. Идрисов, Г.В. Конюхов, Н.М. Василевский; заявитель и патентообладатель ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - № 2018123042; заявл. 25.06.2018; опубл. 21.03.2019, Бюл.  -№ 9.
3. Галлямова М.Ю., Вагин К.Н., Гайнутдинов Т.Р., Василевский Н.М., Идрисов А.М., Рахматуллина Г.И. Фенотипическая изменчивость E. coli, индуцированная γ-лучами  ⁶⁰Co ./ Журнал для профессионалов от профессионалов – 2021. - С. 2.  DOI 10.33632/1998-698Х.2021-3-19-23.
4. Maity, J.P., Kar, S., Banerjee, S., Sudershan, M., Chakraborty, A., Subhas C. Santra, S.C., 2011. Effects of gamma radiation on fungi infected rice (in vitro).  Environmental  Science, University of Kalyani, Nadia, 87(11).  – 2011. – С. 1097-1102.   (doi:10.3109/09553002.2011.606288).
5. Tiryaki, O., Maden, S.,. Penicillium expansum, Botrytis cinerea ve Rhizopus nigricans ile Enfekteli Ankara Armutlarında Gamma Radyasyonunu ile Standart Depolama Koşullarında Çürümenin Engellenmesi. VI. T. Fitopatoloji Kongresi. Ekim, İzmir. – 1991. – С. 7-11
6. Temur, C., Tiryaki, O., Irradiation alone or comined with other alternative treatments to control postharvest diseases./ African Journal of Agricultural Research. – 2013. 8(5): - С. 421-434.
7. M.S. Shathele. Effects of Gamma Irradiation on Fungal Growth and Associated Pathogens/ Research Journal of Environmental Toxicology. - 2009. 3: - С. 94-100. DOI: 10.3923/rjet.2009.94.100.
8. Авчиева П.Б. Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger: диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук: – М. – 1997. – С. 85.
9. Никифорова Т.А. Теоритические и практические аспекты микробиологического производства лимонной кислоты: диссертация в форме доклада на соискание ученой степени доктора технических наук. 03.00.23 –Биотехнология. Санкт-Петербург. – 1999. – С. 26.
10. Kapooir K.K., Chaudhury K., Tauro P/ In Prescott and Dunn’s Industrial microbiology.  – 1982. – С . 709-747.
11. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М.: МГУ. – 1995 . – С. 119 .
12. Патент № IAP 07072. Пулатова О.М., Алимова Б.Х., Махсумханов А.А., Ташбаев Ш.А., Камбаралиева М.И., Холмурадова Н.К. Экспресс-способ для первичного отбора кислотообразующих мицелиальных грибов./ Заявитель и патентообладатель Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, UZ.   Патентная заявка № IAP 20190069; дата подачи 21.02.2019, дата получения 22.08.2022.
13. Abdel-Kadar A. Potential applications of ionizing radiations in postharvest handling of fresh fruits and vegetables./  Food Technology. – 1986. - 40(6), - С. 117-121.
14. Smith, J.C. and S. Pillai.  Irradiation and food safety / Food Technol. - 2004. 58: – С. 48-54.
15. Конюхов, Г.В. Биотехнология и ее значение в создании радиозащитных препаратов / Г.В. Конюхов, Р.Н. Низамов, Н.Б. Тарасова, К.Н. Вагин, Р.Р. Гайзатуллин // Ветеринарный врач. -2011. – N 6. - С. 24-28.