ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНДОФИТНЫХ ГРИБОВ НА АКТИВНОСТЬ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ, ИНГИБИРУЮЩИХ ПАНКРЕАТИЧЕСКУЮ ЛИПАЗУ

АННОТАЦИЯ

Для лечения ожирения и связанных с ним хронических заболеваний важное значение имеет поиск ингибиторов панкреатической липазы (ПЛ), обладающих терапевтическим потенциалом. В статье представлены данные о влиянии питательных сред и условий культивирования на рост биомассы и активность вторичных метаболитов, ингибирующих панкреатическую липазу, в эндофитных грибах Aspergillus.sp. VOR1 и Fusarium sp.-AL142R, выделенных из Viola odorata и Allium longicuspis. Культивирование проводили на 5-ти питательных средах и в разных режимах ферментации. Установлено, что и глубинное, и поверхностное культивирование штаммов Aspergillus sp. VOR1 и Fusarium sp.-AL142R обеспечивает достаточно высокий уровень продукции ингибиторов ПЛ с активностью от 55,6%, до 75% на картофельно-декстрозной, соево-декстрозной средах и среде Чапека-Докса. Полученные данные показывают, что эндофитные грибы Aspergillus sp. VOR1 и Fusarium sp.AL142R могут рассматриваться как перспективные источники ингибиторов панкреатической липазы для разработки новых терапевтических препаратов от ожирения.

ABSTRACT

For the treatment of obesity and related chronic diseases, it is important to search for pancreatic lipase (PL) inhibitors with therapeutic potential. One of the sources of such compounds are endophytic fungi that live in the internal tissues of plants and are recognized as a new rich resource of bioactive compounds. Taking into account the complex growth and development cycle of microscopic fungi and the heterogeneous nature of metabolic processes, we studied the nature of biomass growth and inhibitory activity of secondary metabolites of selected active strains of Aspergillus sp. VOR1 and Fusarium sp. - AL142R during their cultivation on 5 nutrient media and in different fermentation modes. It has been established that both deep and surface cultivation of Aspergillus sp strains. VOR1 and Fusarium sp. - AL142R provides a sufficiently high production of PL inhibitors with significant activity on potato-dextrose, soy-dextrose media and Chapec-Dox media, ranging from 55.6% to 75% inhibition.

Thus, endophytic fungi Aspergillus sp. VAR1 and Fusarium sp.AL142R can be considered as promising sources of pancreatic lipase inhibitors for the development of new therapeutic drugs against obesity.

Ключевые слова: эндофиты, вторичные метаболиты, ингибиторная активность ПЛ, культивирование, Орлистат.

Keywords: endophytes, secondary metabolites, inhibitory activity of PL, cultivation, Orlistat.

В последнее время наблюдается возрастание ожирения среди всех возрастных групп населения всего мира. Ожирение представляет собой сложное заболевание, вызывающее риск нарушения здоровья, в том числе, диабет, метаболический синдром, коронарные заболевания, рак, инсульт и т.д. По уровню смертности ожирение занимает пятое место в мире [1−3].

Основным ферментом, ответственным за расщепление 70% жиров до моноглицеридов и свободных жирных кислот, является панкреатическая липаза (ПЛ), выделяемая поджелудочной железой. Ингибирование активности этого фермента помогает уменьшить накопление жира в жировых тканях и считается одной из эффективных стратегий лечения ожирения [4].

Применяемый в настоящее время ингибитор липазы Орлистат вызывает серьезные побочные осложнения, включая бессонницу, головную боль, сухость во рту, запор, высокое кровяное давление и сердечный приступ [5−6]. Поэтому исследования микробных натуральных продуктов, в частности, эндофитных грибов лекарственных растений, становятся предметом повышенного интереса [7]. Это связано с тем, что эндофиты, группа микроорганизмов, бессимптомно обитающих внутри тканей растений, признаны как огромный и мало исследованный ресурс уникальных химических структур. Более того, эндофитные грибы, являясь богатым источником новых биологически активных натуральных продуктов, рассматриваются как важные альтернативные источники растительных метаболитов терапевтического назначения [8]. Перспективность эндофитных грибов как возможных продуцентов соединений для лечения ожирения впервые была показана Гупта и др. [9−10]. Авторами из растения Aegle marmelos было выделено 70 эндофитных грибов, из которых один изолят, отнесенный к Penicillium, имел значение IC50=3.69мг/мл, сравнимое с IC50 Орлистата (2.73 мг/мл) как позитивного контроля [11−12]. Sarkar et al. [13] показали, что 2 штамма, выделенные из Citrus lemon и Aegle marmelos, ингибировали активность липазы на 75% и 83%, соответственно. При этом в составе метаболитов изолята, идентифицированного как Pestalotiоpsis sp., содержится ингибиторное вещество с активностью 87% и IC50=15,46 мкг/мкл. Полное ингибирование ПЛ экстрактами эндофитов лимона было показано Patil et al. [14]. Так, при скрининге экстрактов 18 эндофитов из 6 местных растений методом фенол красного агара с оливковым маслом, было выявлено полное отсутствие желтого ореола при действии экстракта CLL-2 и частичное торможение панкреатической липазы экcтрактом CLL-1 из Citrus lemon [14].

Вместе с тем, эффективность микроорганизмов как продуцентов критически зависит от параметров культивирования [15]. Для описания влияния параметров ферментации на биосинтез вторичных метаболитов любым микроорганизмом от увеличения числа продуцируемых веществ до появления ранее неизвестных натуральных продуктов, предложен термин «OSMAC» (один штамм – много веществ) [16−18]. Было показано, что варьирование таких условий культивирования как состав среды, аэрация, температура, форма колбы ведут к открытию новых натуральных продуктов с различными грибами и актиномицетами. Особенно наглядно это проявляется на эндофитах, так как между эндофитным грибом, растением-хозяином и другими эндофитами существуют многосторонние и изменчивые взаимодействия.

Kusari в соавторстве с другими учеными [19] подчеркивает, что «в последнее время биосинтетический потенциал эндофитных грибов дает стимул для дальнейших исследований благодаря непрерывному обнаружению эндофитных грибов, способных синтезировать растительные вещества» [19]. Однако устойчивая продукция желаемых соединений с помощью эндофитов еще не достигнута. Возможно, это обусловлено снижением уровня синтеза грибных метаболитов во время длительного культивирования некоторых эндофитов [20]. Например, продукция камптотецина при cубкультивировании одного эндофита - продуцента начинает затухать к седьмой генерации, либо полностью теряется в других грибных штаммах продуцентах рода Aspergillus. В то же время виды Trichoderma продуцируют камптотецин в такой же степени даже после 8 генераций, то есть, это может также зависеть от вида эндофита [21].

Хотя эндофиты могут расти на обычных питательных средах, в лабораторных условиях, но даже легкие изменения в условиях культивирования in vitro могут оказывать влияние на тип и спектр продуцируемых вторичных метаболитов. Следовательно, для достижения устойчивой продукции желаемого вторичного метаболита необходимо установление оптимального набора параметров культивирования эндофитов.

Нами в предыдущих исследованиях из местных лекарственных растений, собранных в окрестностях г. Ташкента (Узбекистан), был выделен ряд эндофитных грибов и отобраны штаммы Aspergillus sp. VOR1, выделенного из корня растения Viola odorata и Fusarium sp. - AL142R выделенный из корня Allium filidens, обладающие способностью подавлять активность панкреатической липазы на 75% и 73,7%, соответственно.

В этой связи целью настоящей работы было изучение влияния состава питательных сред и условий культивирования на ингибиторную активность вторичных метаболитов.

Материалы и методы исследования

Источники и выделение эндофитных грибов

Выделение эндофитных грибов проводили по Hazalin et al. [22] из корней, стеблей, листьев и соцветий собранных растений. После предварительной обработки 70% этанолом в течение 1 минуты и промывки стерильной водой, каждый сегмент растения асептически измельчали на кусочки размером не более 0,5 см и помещали на чашки Петри с агаризованной средой Чапек-Докс, содержащей хлортетрациклин в концентрации 50 мг/мл и сульфат стрептомицина в концентрации 250 мг/мл для подавления роста бактериальной микрофлоры. Чашки инкубировали в течении 7−14 дней при температуре 28⁰С. Выросшие грибные изоляты пересевали на среду Чапека-Докса, не содержащую антибиотики. Собранные сырые материалы хранили при 4−5 °С ±2°С и использовали для проверки активности ингибирования липазы.

Идентификация и хранение грибов – эндофитов

Изоляты идентифицировали до рода, изучая морфологические признаки семисуточных культур, выращенных на среде Чапек-Докс по форме колоний, характеру роста на питательной среде, форме конидий и спор, пигментации колоний [23]. Препарат клеток готовили с использованием уксусной кислоты. Строение клеток изучали с помощью бинокулярного микроскопа NLCD-307B (Китай), при увеличении 10х40. Культуры сохраняли на скошенном агаре Чапек-Докс при 4−5 °С ±2°С в течение 3 месяцев с последующим пересевом на свежую питательную среду.

Культивирование эндофитов

Ферментацию выделенных эндофитов проводили в 250 мл колбах, содержащих 100 мл среды в течении 7 дней при 28⁰С в глубинных условиях на качалке при 180 об/мин и поверхностное − в термостате. Биомассу культур отделяли центрифугированием при 6 тыс. об/мин. и хранили при +4^оС.

Получение экстрактов вторичных метаболитов из биомассы грибов-эндофитов

Экстракцию метаболитов из биомассы грибов-эндофитов проводили по Hazalin et al [22]. Для этого 5 г биомассы гомогенизировали и переносили в коническую колбу, содержащую 50 мл этилацетата, оставляли на сутки на качалке при комнатной температуре для перемешивания. Затем смесь отфильтровывали через бумажный фильтр (ватман №1) и добавляли Na₂SO₄ из расчета 40 мкг/мл для удаления водного слоя. Далее смесь упаривали досуха на роторном испарителе и добавляли 1 мл диметильсульфоксида. Полученный экстракт использовали как маточный раствор и хранили при температуре +4⁰С.

Количественный анализ ингибирования панкраетической липазы (ПЛ)

Субстратом служил p-нитрофенилпальмитат. 50 мг липазы (“Sigma”,100 ед/мл) суспендировали в 10 мл трис-HCl буфера, содержащего 2,5 мМ трис и 2,5 мМ NaCl, pH 7,4. Раствор интенсивно встряхивали в течение 15 мин и центрифугировали при 4000 об/мин. 10 мин и отбирали супернатант. Исходные растворы экстрактов и ксеникала готовили в ДМСО с линейными концентрациями в диапазоне 1,56–2000 мкг/мл или 0,78–1000 мкг/мл. Конечная реакционная смеси состояла из 875 мкл буфера, 100 мкл фермента и 20 мкл экстракта в различной исходной концентрации, предварительно инкубированных в течение 5 мин. при 37^оC с последующим добавлением 10 мкл субстрата (4-нитрофенилпальмитата в 10 мМ в ацетонитриле). Количество ДМСО в конечной концентрации не превышало 2%. Оптическую смесь измеряли на спектрофотометре (УФ-вид модели UV-5100) через 5 минут при 405 нм (17). Процент ингибирования рассчитывали по формуле:

% ингибирования = [(Ae-At)/Ae]x100,

где  Aе − это оптическая плотность ферментного контроля (без ингибитора),

а At − разница между оптической плотностью исследуемого образца с субстратом и без него. В качестве препарата сравнения использовали Ксеникал [24].

Для изучения влияния условий культивирования отобранных штаммов использовали питательные среды, обычно используемые при исследовании биоактивности эндофитных грибов [25, 26] (г/л):

Среда 1 (солодово-дрожжевая): 12% сусло − 80 мл, дрожжевой экстракт – 2.

Среда 2 (соево-декстрозная): соевая мука − 10, декстроза − 10.

Среда 3 (картофельно-декстрозная): картофельный настой − 100, декстроза – 20.

Среда 4 (мясо-пептонная): пептон − 5, говяжий экстракт − 5, NaCL − 5.

Среда 5 (Чапека-Докса): NaNO₃ − 2, MgSO₄ – 0,5, KCL-0,5, FeSO₄ – 10 мг, KH₂PO₄ − 1,0, сахароза − 20 мг, рН 6−6,5.

Все эксперименты проводили в 3-х повторениях.

Результаты и обсуждение

Прямая зависимость синтеза вторичных метаболитов от условий ферментации была показана при изучении 29 штаммов эндофитных грибов Nodulisporium Monaghan в соавторстве с другими учеными пишет, что при этом между различными условиями ферментации наблюдалась более, чем 400-кратная разница в концентрации синтезируемых метаболитов [27].

При изучении 760 штаммов эндофитов Yarbrough с соавторами [28] установили, что для усиления продукции вторичных метаболитов необходимо несколько различных условий выращивания. Влияние состава сред на вторичный синтез особенно ярко показано в работе Paranagama и других исследователей [29], где эндофит Paraphaeosphaeria quadriseptata начинает синтезировать шесть новых вторичных метаболитов, даже когда вода для среды из проточной меняется на дистиллированную. При изменении среды выращивания Chaetomium chiversii с твердой на жидкую привело к продукции радицикола вместо хетохромина A.

Как видно из данных, представленных в таблицах 1 и 2, и на рис.1−2, при ферментации Aspergillus sp. VOR1 и Fusarium sp. AL142R состав питательной среды и условия культивирования в целом заметно влияют на как рост эндофитной биомассы и уровня вторичных метаболитов, так и на ПЛ ингибиторную активность экстрактов. Следует отметить, что использованные питательные среды довольно сильно отличаются между собой по составу, вследствие чего и их влияние на регистрируемые параметры роста и ингибиторную активность в пределах каждого отдельного изолята отличались.

Как видно из данных, представленных на рис.1, ингибиторную активность суммы вторичных метаболитов Aspergillus sp. VOR1 определяли в условиях глубинного и поверхностного культивирования на пяти средах.

Ингибиторная активность экстрактов эндофитных грибов на различных питательных средах при глубинном (ГК) и поверхностном (ПК) культивировании.

Рисунок 1. Влияние условий культивирования на рост и ингибиторную активность экстракта вторичных метаболитов Aspergillus sp. VOR1

Наиболее заметное наблюдение сводится к тому, что уровень роста биомассы Aspergillus sp. VOR1 гораздо более низкий при поверхностном по сравнению с глубинным культивированием на всех средах, за исключением среды 4 (мясо-пептонная), что вполне ожидаемо (рис.1).

Таблица 1.

Количество биомассы, сухого экстракта вторичных метаболитов Aspergillus sp.VOR1 и их ингибиторная активность на разных средах

Вместе с тем, концентрация экстрагируемых вторичных метаболитов и их ингибиторная активность при поверхностных условиях выше на всех средах, кроме среды Чапек-Докс и варьирует от минимальной 26% на среде 3 (картофельно-декстрозной) до максимальной 55,6% на среде 2 (соево-декстрозной). Следует отметить, что на среде 2 отмечена самая большая концентрация вторичных метаболитов, составившая 62 мг.

При культивировании в глубинных условиях ПЛ ингибирующая активность метаболитов Aspergillus sp. VOR1 варьировала от минимальной в 14, 9% на среде 3, до максимальной в 75% на среде 5 (Чапек-Докс), на которой также отмечался высокий уровень синтеза вторичных метаболитов (42 мг). В целом, данные показывают, что наиболее активные ингибиторные метаболиты продуцируются при глубинном культивировании Aspergillus sp. VOR1 на среде Чапека-Докса, где ингибирование ПЛ составляет 75%, и среда 2, обеспечивающая в стационарных условиях высокий выход метаболитов (62 мг) со значительной ингибиторной активностью в 55,6%. Следует отметить, что ингибиторная активность Ксеникала (Орлистат) как препарата сравнения в условиях эксперимента составляет 72%.

При культивировании Fusarium sp.-AL142R также установлено, что условия культивирования и среды по-разному влияют на рост биомассы, синтез вторичных метаболитов и их ингибиторную активность (рис.2).

Рисунок 2. Влияние условий культивирования на рост и ингибиторную активность экстракта вторичных метаболитов Fusarium sp.-AL142R

В отличие от эндофита Aspergillus sp.VOR1, выход сухого экстракта в штамме Fusarium sp.-AL142R в целом ниже при поверхностных условиях. При этом прямой зависимости от уровня роста культуры не прослеживается. Более того, на некоторых средах, например, среде 4 повышение ингибиторной активности в поверхностных условиях по сравнению с глубинным происходит на фоне снижения количества экстрагируемых вторичных метаболитов.

Наиболее сильное ингибирования ПЛ экстрактами Fusarium sp.-AL142R наблюдались при глубинном культивировании на среде 1 (61%), и на среде Чапека, где уровень и ингибирования ПЛ имел величину 73,7%, что сравнимо с действием Ксеникала как стандарта (72%). Максимальная ингибиторная активность экстрактов, полученных в условиях поверхностного культивирования, отмечена при выращивании Fusarium sp.-AL142R на соево-декстрозной среде (среда 2). Экстракты, полученные на этой среде, проявляли более умеренную ингибиторную активность, составляющую 55,6% (табл.2).

Таблица 2.

Количество биомассы, вторичных метаболитов Fusarium sp. - AL142R и ингибиторная активность на разных средах

Таким образом, полученные данные показывают, что условия культивирования и состав питательной среды действительно оказывают сильное влияние на ингибиторную активность метаболитов эндофитов. Это свидетельствует о необходимости правильного подбора сред и условий культивирования потенциальных продуцентов, которые могут обеспечить достаточно высокий выход активных ингибиторов панкреатической липазы. Поскольку в опытах рассматривается сумма вторичных метаболитов, то прямой зависимости ингибиторной активности от концентрации вторичных метаболитов пока не отмечено, можно судить лишь о доле ингибиторных веществ в сумме экстрагированных вторичных метаболитов. Однако, мы предполагаем, что определение такой зависимости возможно после дальнейшей идентификации и очистки ингибиторных веществ.

В отношении эндофитов Aspergillus sp.VOR1 и Fusarium sp.-AL142R можно заключить, что и глубинное, и поверхностное культивирование обеспечивает достаточно высокую продукцию ингибиторов ПЛ со значительной активностью на картофельно-декстрозной, соево-декстрозной средах и среде Чапека-Докса, составляющей от 55,6% до 75% ингибирования.

Из совокупности полученных данных следует, что эндофитные грибы Aspergillus sp. VOR1, выделенные из корня Viola odorata и Fusarium sp AL142R из корня Allium filidens, могут рассматриваться как перспективные источники ингибиторов панкреатической липазы для разработки новых терапевтических препаратов от ожирения.

Список литературы:

1. Grundy S.M. Multifactorial causation of obesity: implications for prevention // American Journal of Clinical Nutrition. 1998. Vol. 67(3). P. 563–572.
2. World Health Organization Obesity and overweight. Available at: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight Accessed 9 June 2021.
3. World Health Organization. World health statistics 2015. Available from: https://www.who.int/docs/default-source/gho-documents/world-health-statistic-reports/world-health-statistics-2015.pdf.
4. Khaodhiar L., McCowen K.C., Blackburn G.L. Obesity and its comorbid conditions. Clinical Cornerstone. Vol. 2. P. 17–31.
5. Orlistat (marketed as Alli and Xenical) Information. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm180076.htm. Accessed 9 June 2021.
6. Weibel E.K, Hadvary P, Hochuli E, Kupfer E, Lengsfeld H. Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activity // Journal of Antibiotics. 1987. Vol. 40. P.1081–1085.
7. Dias D.A., Urban S., Roessner U. A historical overview of natural products in drug discovery. Meta. 2012. Vol. 2. P. 303–336.
8. Aly A.H., Debbab A., Kjer J, Proksch P. (2010) Fungal endophytes from higher plants: a prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products. Fungal Divers. Vol. 41(1). P. 1–16.
9. Gupta S., Chaturvedi P., Kulkarni M., van Staden J. A critical review on exploiting the pharmaceutical potential of plant endophytic fungi // Biotechnological Advances. 2019. Vol. 39. P. 107−462.
10. Gupta J., Singh S.K. Role of Endophytes in Pharmaceutical Industry // Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 4 (1).
11. Gupta M., Saxena S., Goyal D. Potential pancreatic lipase inhibitory activity of an endophytic Penicillium species. Journal of Enzyme Inhibited Medical Chemistry. 2015. Vol. 30. P. 15–21.
12. Gupta M., Saxena S., Goyal D. Lipase inhibitory activity of an endophytic fungal species of Aegle marmelos: a bioresource for potential pancreatic lipase inhibitors. Symbiosis. 2014. Vol. 64. P. 149–157.
13. Sarkar U.J., Dioundi D., Gupta M. Endophytic Pestalotiopsis species from Andaman islands: a potential pancreatic lipase inhibitors // Asian Journal Pharmacia Clinical Researches. Vol. 10. Issue 10. 2017. P. 82–83.
14. Patil M.P., Patil R.H. Data on the inhibitory effect of endophytic fungi of traditional medicinal plants against pancreatic lipase (PL). 2019. Data in brief. 27: Article 104797.
15. Scherlach K., Hertweck C. Triggering cryptic natural product biosynthesis in microorganisms. Organic Biological Chemistry. Vol. 7. 2009. P. 1753–1760.
16. Grond S., Papastavrou I., Zeeck A. Novel a-L-rhamnopyrano-sides from a single strain of Streptomyces by supplement-induced biosynthetic steps. European Journal Organic Chemistry. 2002. P. 3237–3242.
17. Bode H.B., Bethe B., Ho R., Zeeck A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature’s chemical diversity. Journal of Biological Chemistry. 2002. Vol. 3. P. 619–627.
18. Rateb M.E., Houssen W.E., Harrison W.T., Deng H., Okoro C.K., Asenjo J.A., Andrews B.A., Bull A.T., Goodfellow M., Ebel R. Diverse metabolic profiles of a Streptomyces strain isolated from a hyper-arid environment. Journal of Natural Products. 2011. Vol. 74. P. 1965–1971.
19. Kusari S., Hertweck C., Spiteller M. Chemical Ecology of Endophytic Fungi: Origins of Secondary Metabolites. Chemistry & Biology 19, July 27, 2012.
20. Gandhi S.G., Mahajan V., Bedi Y.S. Changing trends in biotechnology of secondary metabolism in medicinal and aromatic plants. Planta. 2015. Vol. 241, P. 303–317.
21. Pu X., Qu X., Chen F., Bao J., Zhang G., Luo Y. Camptothecin-producing endophytic fungus Trichoderma atroviride LY357: isolation, identification, and fermentation conditions optimization for camptothecin production. Applied Microbiology and Biotechnology. 2013. Vol. 97. P. 9365–9375.
22. Hazalin N.A., Ramasamy K., Lim S.M., Wahab I.A., Cole A.Lj., Majeed A.A. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia. BMC Complementary and alternative medicine. 2009. Vol. 9. P. 46.
23. Litvinov M.A. Identification guide for microscopic fungi. Nauka, Leningrad. 1967.
24. M. Katoch, A. Paul, G. Singh and S. N. C. Sridhar. Fungal endophytes associated with Viola odorata Linn. as bioresource for pancreatic lipase inhibitors Katoch et al. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2017. Vol. 17. P. 385 doi: 10.1186/s12906-017-1893-y.
25. Pavithra N., Sathish L., Nagasai B., Venkatarathanamma V., Pushpalatha H., Reddy B., Ananda K. Evaluation of α-amylase, α-glucosidase and aldose reductase inhibitors in ethylacetate extracts of endophytic fungi isolated from antidiabetic plants. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2014. Vol. 5(12). P. 5334–5341.
26. Ushasri R., Anusha R. In vitro anti-diabetic activity of ethanolic and acetone extracts of endophytic fungi Syncephalastrum racemosum isolated from the seaweed Gracilaria corticata by alpha-amylase inhibition assay method. International Journal of Current Microbiological Applied Sciences. 2015. Vol. 4(1). P. 254–259.
27. Monaghan R. L., Polishook J. D., Pecore V. J., Bills G. F., Nallin-Omstead M., Streicher S. L. Discovery of novel secondary metabolites from fungi – is it really a random walk through a random forest? // Canadian Journal of Botanic. 1995. Vol. 73. P. 925–931.
28. Yarbrough G.G, Taylor D.P., Rowlands R.T., Crawford M.S. Screening microbial metabolites for new drugs: theoretical and practical issues // Journal of Antibiotics. 1993. Vol. 46. P. 535–544.
29. Paranagama P.A., Wijeratne K.E.M. Uncovering biosynthetic potential of plant-associated fungi: effect of culture conditions on metabolite production by Paraphaeosphaeria quadriseptata and Chaetomium chiversii // Journal of Natural Products. 2007. Vol.70. P. 1939–1945.