АНТИАМИЛОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТА Rhodiola heterodonta УСЛОВИЯХ IN VIVO И IN VITRO

АННОТАЦИЯ

В данной статье рассмотрено влияние Rhodiola heterodonta на течение экспериментального сахарного диабета и представлены результаты антиамилолитической активности экстракта в условиях in vivo и in vitro. В ходе проведенных исследований было определено, что экстракт Rhodiola heterodonta ингибирует активность фермента α-амилазы.

ABSTRACT

This article discusses the effect of Rhodiola heterodonta on the course of experimental diabetes mellitus and presents the results of the antiamylolytic activity of the extract in vivo and in vitro. In the course of the studies carried out, it was determined that Rhodiola heterodonta inhibits the activity of the α-amylase enzyme.

Ключевые слова: родиола, поджелудочная железа, кишечник, альфа амилаза, аллоксан, гипергликемия.

Keywords: rhodiola, pancreas, intestines, alpha amylase, alloxan, hyperglycemia

Амилаза представляет собой пищеварительный фермент, преимущественно секретируемый поджелудочной железой и слюнными железами и обнаруживаемый в других тканях в очень малых количествах [1].

Основная функция амилаз заключается в гидролизе гликозидных связей в молекулах крахмала, превращении сложных углеводов в простые сахара. Существует три основных класса ферментов амилазы: α-, β- и γ-амилазы, которые действуют на разные участки молекулы углевода. α -амилазу можно найти у людей, животных, растений и микробов. β-амилаза содержится в микробах и растениях. γ-амилаза обнаружена у животных и растений [2].

Ингибирование ферментов – это общефизиологический процесс [3]. Ингибиторы амилазы играют защитную роль у больных диабетом [4]. Сахарный диабет представляет собой метаболическое нарушение с множественной этиологией, особенно характеризующееся хронической гипергликемией наряду с нарушением углеводного, белкового и жирового обмена, вызванное нарушением секреции инсулина или действием инсулина. Регулировать уровень глюкозы в крови можно с помощью пероральных гипогликемических препаратов, а именно бигуанидов, средств, стимулирующих секрецию инсулина, и ингибиторов α-амилазы [5]. Клинически используемые ингибиторы α-амилазы представляют собой акарбозу, миглитол и воглибозу [6]. Акарбоза является ингибитором амилазы, который отстает от переваривания углеводов, вызывая снижение скорости усвоения глюкозы в организме [7, 8].

Растения обеспечивают эффективный потенциал для ингибирования α-амилазы и могут использоваться в качестве терапевтических источников для вмешательства при нарушениях приема углеводов, таких как диабет и ожирение, как подчеркивается в Аюрведе. Было проведено достаточное количество исследований для идентификации и характеристики соединений из растительных источников, которые были проверены на ингибирующую активность в отношении α-амилазы.

Более 800 видов растений были идентифицированы как потенциальные средства лечения сахарного диабета [9]. Гровер и др. [10] заявили, что более 1123 видов растений использовались этнофармакологически или экспериментально для лечения пациентов с диабетом. Выделено более 200 чистых соединений из растительных источников, которые, как сообщается, обладают способностью снижать уровень глюкозы в крови [11]. Фармакологические механизмы трав можно классифицировать как (1) снижение всасывания углеводов, (2) улучшение чувствительности к инсулину, (3) увеличение периферического поглощения глюкозы, (4) стимуляция секреции инсулина, (5) потенцирование эндогенных инкретинов, (6) проявление антиоксидантных эффектов и снижение клеточного апоптоза и (7) увеличение гликогенеза или ингибирование гликогенолиза в печени [12, 13, 14]. Различные составы состоят из нескольких экстрактов и соединений, которые проявляют несколько механизмов. Сообщается, что различные соединения растительного происхождения, такие как алкалоиды, стероиды, гликозиды, гуанидин, галактоманнановая камедь, полисахариды, пептидогликаны, гипогликаны, терпеноиды и гликопептиды, обладают биологической активностью против гипергликемии [15].

Цель. Целью данной работы является исследование влияния 70 % ного этанольного экстракта корней Rhodiola heterodonta, произрастающий на территории Узбекистана, на активность α-амилазы поджелудочной железы крыс при условиях in vitro и при экспериментальной модели аллоксанового диабета у животных.

Материалы и методы.

Эксперименты на животных

Экспериментальные животные, всего 72 здоровых взрослых беспородных крыс-самцов (200 ± 20 г) были получены из фармакологической лаборатории (Институт биоорганической химии АН, Ташкент, Узбекистан). Экспериментальные исследования на животных проводились при соблюдении всех этических норм, указанных в протоколе Комитета по этике животных Института. Экспериментальный дизайн был аналогичен плану исследований, описанных Litchfield JT et.al. [21] с некоторыми изменениями.

Растительные образцы и реактивы

Сухие экстракты корней Rhodiola heterodonta (родиола разнозубчатая) был предоставлен ООО «БИОТОН». Все используемые реагенты были местного производства марки х.ч. или ч.д.а.

Создание модели аллоксанового диабета

В экспериментальных исследованиях аллоксан использовался для индукции диабета у животных. Крыс, выделенных для эксперимента, разделили на группы: I группа − контроль (n = 6), II группа −  опыт (аллоксановый диабет, n = 6), III группа −  опыт (аллоксановый диабет + экстракт, n = 6). В 1 и 3 группах лаборатории для выведения диабета у животных через сутки голодания однодневный раствор аллоксана 100 мг/кг (5% 0,2 мл дистиллированной воды) [22] вводили подкожно в брюшную полость. Образцы крови брали каждые 3 дня у крыс с аллоксановым сахарным диабетом и определяли уровень глюкозы. Через 12 дней после введения аллоксана крысам, когда уровень глюкозы в крови превышал 11 ммоль / л, животным II группы вводили по 0,2 мл 0,9% раствора NaCl 1 раз в сутки, а экстракты 1 раз в сутки в течение 8 дней виде инъекций и перорально.

Забой животных проводили всегда в одно и то же время − между 9.00 и 10.00 утра. При декапитации животных кровь собирали в парафиновые центрифужные пробирки и отстраивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем пробы крови центрифугировали со скоростью 5000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант осторожно отсасывали для определения в нем уровня глюкозы [23].

Изучение ингибирующих свойств α-амилазы in vitro

После очистки, отделенные от брюшной полости поджелудочной железы и тонкой кишки, от жировой ткани, компоненты взвешивают и гомогенизируют в гомогенизаторе из тефлонового стекла со скоростью 400 об/мин в течение 2-3 минут. Полученный гомогенат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Для эксперимента недостающую часть отделяют и хранят на льду. Ингибирующую активность образцов по α-амилазе определяли в гомогенате поджелудочной железы и тонкой кишки по А. М. Уголеву [24]. Количество белка в ткани определяли методом Лоури в модификации Hartree [25].

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы OriginPro 6.1 (Microsoft, США). Эксперименты проводились путем вычисления среднего арифметического 4–7 различных опытов. Разницу между значениями, полученными в контроле, опыте и опыте + объект исследования, рассчитывали по t-критерию. Значения R<0,01 и R<0,001 представляют собой статистическую достоверность.

Полученные результаты

Ингибиторы α-амилазы, секретируемые в слюнных железах, поджелудочной железы, двенадцатиперстной кишке и т.д., подавляют активность фермента в условиях in vitro и in vivo. Селективные ингибиторы α-амилазы являются эффективным средством контроля уровня сахара в крови при лечении диабета.

Поскольку сведений о влиянии видов растений, произрастающих в Узбекистане, на активность фермента α-амилазы в литературе не обнаружено, нами было изучено влияние растения Rhodiola heterodonta на активность этого фермента.

Специфическая активность α-амилазы в гомогенате поджелудочной железы и тонкой кишке крыс при добавлении экстракта снижалась по сравнению с контролем (таблица 1). В качестве препарата сравнения использовали природный инулиновый БАД. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Влияние экстракта родиолы на α-амилолитическую активность в условиях in vitro

Как видно из результатов, представленных в таблице, активность α-амилазы в гомогенате поджелудочной железы составила 80,1±2,4 мг/мин/мг белка, а в тонкой кишке – 58,1±2,4 мг/мин/мг белка. При добавлении гомогенату поджелудочной железы экстракта Rhodiola heterodonta в концентрации 10 мг/мл, активность фермента α-амилазы составляла 75,6 мг/мин/мг белка. В данном случае экстракт Rhodiola heterodonta проявлял способность ингибировать активность амилазы до 50%.

При добавлении к гомогенату тонкой кишки экстракта Rhodiola heterodonta, активность фермента составляла 50 мг/мин/мг белка. В данном случае также видно, что экстракт Rhodiola heterodonta ингибирует активность фермента α-амилазы в гомогенате тонкой кишки на 32% по сравнению с контролем. Для сравнения антиамилолитической активности Rhodiola heterodonta использовали концентрат природного инулина (БАД).

На основании полученных результатов установлено, что экстракт Rhodiola heterodonta влияет на активность α-амилазы в условиях in vitro, проявляя тем самым ингибирующую активность различной степени в зависимости от концентрации экстракта.

Далее в работе исследовалась антиамилолитическая активность экстракта в условиях in vivo Для этого, вызывали экспериментальную модель аллоксанового диабета у животных и через 12 дней после моделирования диабета перорально вводили экстракт Rhodiola heterodonta в количестве 50 мг/кг массы тела животных в течение 8 дней. Полученные результаты по антиамилолитической активности экстракта в условиях in vivo приведены в таблице – 2.

Таблица 2.

Результаты по антиамилолитической активности экстракта в условиях in vivo

Как видно из результатов, представленных в таблице, модельные крысы с диабетом, которым перорально вводили экстракт Rhodiola heterodonta количество крахмала в гомогенате поджелудочной железы составило 1800,1 ± 245,2 мг/мин/мг, а амилолитическая активность составила 83%.

Количество крахмала в гомогенате тонкой кишки составляло 17,74 ± 1,66 мг/мин/мг у здоровых крыс и 17,7 ± 1,73 мг/мин/мг у крыс, получавших экстракт родиолы гетеродонта. Амилолитическая активность равна 98,6%.

На основании полученных результатов установлено, что растение Rhodiola heterodonta влияет на активность α-амилазы in vivo.

Выводы

Установлено, что исследуемый экстракт корней Rhodiola heterodonta ингибирует активность фермента α-амилазы как в условиях in vitro так и в условиях in vivo и может препятствовать расщеплению полисахаридов, потребляемых с пищей, до глюкозы.

Список литературы:

1. Pieper-Bigelow C., Strocchi A., Levitt M. D. Where does serum amylase come from and where does it go? // Gastroenterology Clinics of North America. 1990. Vol. 19(4). P. 793–810.
2. Azzopardi E., Lloyd C., Teixeira S.R., Conlan R.S., Whitaker I.S. Clinical applications of amylase // Novel perspectives. Surgery. 2016. Vol.160 (1). P. 26-37.
3. Кунакова Р.В., Зайнуллин Р.А., Хуснутдинова Э.К., Ялаев Б.И., Сегура Е.П., Ильина А.Д. Растения как перспективные источники ингибиторов амилазы при разработке функциональных продуктов питания и профилактики сахарного диабета // Вестник Академии Наук РБ. – 2016 – Вып. 21. – № 1. – С. 81.
4. Ali H., Houghton P.J., Amala S. α-amylase inhibitory activity of some Malaysian plants used to treat diabetes: With particular, reference to Phyllanthus amarus // Journal Ethnopharmacol. 2006. Vol.107. Р. 449–455.
5. Kazeem M. I., Dansu, T. V., Adeola, S. A. Inhibitory effect of Azadirachta indica A. juss leaf extract on the activities of alpha-amylase and alpha-glucosidase // Pakistan journal of biological sciences. 2013. Vol. 16 (21). Р. 1358–1362.
6. Bailey C. J. New approaches to the pharmacotherapy of diabetes // Pickup J.C., William G. Textbook of diabetes (volume 2 set) 3-rd edition.  Blackwell Science Ltd, UK. 2003. Р.73.1–73.21.
7. Van de Laar F. A. Alpha-glucosidase inhibitors in the early treatment of type 2 diabetes // Vascular health and risk management. 2008. Vol. 4(6). Р. 1189–1195.
8. Cheng A. Y., Fantus I. G. Oral anti-hyperglycemic therapy for type 2 diabetes mellitus // CMAJ: Canadian Medical Association journal = journal de l'Association medicale canadienne. 2005. Vol. 172 (2). Р. 213–226.
9. Perez G.R.M., Zavala S.M.A., Perez G.S., Perez G.C. Antidiabetic effect of compounds isolated from plants // Phytomedicine: international journal of phytotherapy and phytopharmacology. 1998. Vol. 5 (1). Р.55–75.
10. Grover J. K., Yadav S., Vats, V. Medicinal plants of India with anti-diabetic potential // Journal of Ethnopharmacology. 2002. Vol. 81 (1). Р. 81–100.
11. Marles R.J., Farnsworth N.R. Plants as Sources of Anti-Diabetic Agents // Economic and Medicinal Plant Research by H. Wagner and N.R. Farnsworth. Academic Press Ltd., London. 1994. Р.149-187.
12. Li W.L., Zheng H.C., Bukuru J., De Kimpe, N. Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus // Journal of Ethnopharmacology. 2004. Vol. 92 (1). Р.1-21.
13. Prabhakar P. K., Doble M. Mechanism of action of natural products used in the treatment of diabetes mellitus // Chinese journal of integrative medicine. 2011. Vol.17 (8). Р. 563–574.
14. Bhat M., Zinjarde S.S., Bhargava S.Y., Kumar A.R., Joshi B.N. Antidiabetic Indian plants: a good source of potent amylase inhibitors // Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM. 2011.
15. Mentreddy S.R. Medicinal plant species with potential antidiabetic properties //  Journal Science Food Agriculture. 2007. Vol. 87. P. 743–750.
16. Karthic K., Kirthiram K.S., Sadasivam S., Thayumanavan B. Identification of alpha amylase inhibitors from Syzygium cumini Linn seeds // Indian journal of experimental biology. 2008. Vol. 46 (9). P. 677–680.
17. Conforti F., Statti G., Loizzo M.R., Sacchetti G., Poli F., Menichini F. In Vitro antioxidant effect and inhibition of alpha-amylase of two varieties of Amaranthus caudatus seeds // Biological & pharmaceutical bulletin. 2005. Vol. 28 (6). P. 1098–1102.
18. Kobayashi K., Baba E., Fushiya S., Takano F., Batkhuu J., Dash T., Sanchir C., Yoshizaki F. Screening of Mongolian plants for influence on amylase activity in mouse plasma and gastrointestinal tube // Biological & pharmaceutical bulletin. 2003. Vol. 26 (7). P. 1045–1048.
19. Loizzo M.R., Saab A.M., Tundis R., Menichini F., Bonesi M., Piccolo V., Statti G.A., de Cindio B., Houghton P.J., Menichini F. In vitro inhibitory activities of plants used in Lebanon traditional medicine against angiotensin converting enzyme (ACE) and digestive enzymes related to diabetes // Journal of ethnopharmacology. 2008. Vol. 119 (1). P. 109–116.
20. Bhutani K.K., Gohil V.M. Natural products drug discovery research in India: status and appraisal // Indian Journal of Experimental Biology. 2010. Vol. 48.  P.199–207.
21. Litchfield J.T., Wilcoxon F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments // Journal Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1949. Vol. 96 (2). P. 99–113.
22. Агзамов Х., Алматов К.Т., Рахимов М.М., Туракулов Я.Х. Функционирование митохондрий печени при аллоксановам диабете // Вопросы мед. химии. – 1983. – Т.29. – №1.– С. 61-65.
23. Кучкарова Л.С., Рохимова Ш.О. Кишечное пищеварение углеводов при аллоксановом диабете крыс. // Научное обозрение. Биологические науки. – 2020. – № 3 – С. 56-60.
24. Ugolev A.M. Opredelenie amiloliticheskoj aktivnosti // Issledovanie pishhevaritel'nogo apparata u cheloveka. Leningrad: Nauka. 1969. С. 187–192.
25. Hartree E.F. Determination of protein: A modification of the Lowry method that gives a linear photometric response // Analytical Biochemistry. 1972. Vol. 48 (2). Р. 422-427.