СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ К ГЕНЕРАТОРУ ТЕХНЕЦИЯ-99М НА ОСНОВЕ ЛИГАНДА МЕТИЛЕНДИФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ (MDP) С ОЛОВОМ ДВУХВАЛЕНТНЫМ, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА

АННОТАЦИЯ

Исследованы оптимальные соотношения основного вещества метилендифосфоновой кислоты (лиганда) и восстанавливающего агента двухвалентного олова (Sn²⁺) при приготовлении субстанции МDP(Sn) путем получения радиофармацевтического препарата МDP^99mТс, используемого в медицинской практике для выявления метастазов кости. Изучено влияние концентрации восстанавливающего агента Sn²⁺ и комплексообразователя лиганда на эффективность образования комплекса МDP^99mТс в растворах в пределах 0,8-1,15 мг/мл и 7,0-12,0 мг/мл соответственно и рН среды 4,0-7,0. Установлена эффективность образования устойчивого комплекса  ^99mТс с метилендифосфоновой кислотой МDP^99mТс  более 99,5 % в субстанциях с содержанием: Sn²⁺ 0,95 мг/мл и МDP 10,0 мг/мл и рН раствора 6,0 по истечении 20мин после добавления к субстанции радиоактивного ^99мТсО₄^-. Определена стабильность субстанции МDP хранившейся в течение от 1 до 12 месяцев путем получения радиофармпрепарата МDP^99mТс.

ABSTRACT

The optimal ratios of the main substance methylenediphosphonic acid (ligand) and the reducing agent divalent tin (Sn²⁺) were studied in the preparation of the MDP(Sn) substance by obtaining the MDP^99mTc radiopharmaceutical used in medicine to detect bone metastases.

The influence of the concentration of the reducing agent Sn²⁺ and the ligand complexing agent on the efficiency of the formation of the MDP^99mTc complex in solutions in the range of 0.8-1.15 mg/ml and 7.0-12.0 mg/ml, respectively, and pH 4.0-7.0 was studied.  Efficiency of formation of stable complex ^99mТс with methylenediphosphonic acid МDP^99mТс more than 99.5% in substances containing: Sn²⁺ 0.95 mg/ml and MDP 10.0 mg/ml and solution pH 6.0 after 20 min after addition of radioactive ^99mTcO₄^- to the substance. The stability of the MDP substance stored for 1 to 12 months was determined by obtaining the radiopharmaceutical MDP^99mTc.

Ключевые слова: радиофармацевтический препарат; субстанции; радионуклид; технеций-99м.

Keywords:  radiopharmaceutical; substance; radionuclide; technetium-99m.

Введение

В ядерной медицине, одной из наиболее востребованной диагностикой является диагностика заболеваний скелета. Следует отметить, что метастатическое поражение скелета выявляется в более чем у 60% больных раком молочной железы, легких, предстательной железы, толстой кишки. Для диагностирования этих заболеваний, наиболее чувствительным и специфичным методом является сцинтиграфия остеотропными радиофармацевтическими препаратами (РФП). Метод основан на введении в организм пациента тропного, к костной ткани, РФП, и последующей регистрацией его при распределении и накоплении в скелете. Среди таких соединений особое место занимает бифосфонаты, применяемые при выявлении и терапии любой патологии скелета.

После открытия полифосфата меченным Tc-99m для визуализации костей в 1971 г. Г. Субраманианом  был введен ряд соединений, меченных Tc-99m пирофосфатом и бифосфонатом для визуализации костей [1-7]. Агенты, получившие самое широкое клиническое применение, включают комплексы полифосфата, гидроксиэтилиден дифосфоната (HEDP) и метилендифосфоната c Tc-99m. Гидроксиэтилиден дифосфонат (HEDP) применялся наиболее широко в мире, вплоть до конца восьмидесятых годов и применяется до настоящего времени в России и в Узбекистане под коммерческим названием «Фосфотех, ^99mТс».

Данная работа посвящается исследованию образования комплекса (МDP^99mТс) метилендифосфоновой кислоты (МDP) с радионуклидом технеций-99m, подбирая оптимальные соотношения основного вещества метилендифосфоновой кислоты  и восстанавливающего агента двухвалентного олова (Sn²⁺)   в растворе с разным рН. Также, изучению  кинетики образования комплекса (МDP^99mТс) метилендифосфоновой кислоты (МDP) с радионуклидом технеций-99m  и срок хранения субстанции МDP(Sn).

Методы, материалы, реактивы и оборудования

При приготовлении субстанции комплекса метилендифосфоновой кислоты (MDP) с (II) оловом использованы следующие химические реактивы:

• метилендифосфоновая кислота, Alfa Aesar 99%;
• олово двухлористое, Sigma Aldrich 99%.

В экспериментальных исследованиях использовали метод радиоиндикаторов с использованием радиоактивного нуклида ^99mTcО₄^- полученного из Генератора технеций-99m производства ГП «Радиопрепарат».

Радиометрические измерения образцов проводились в гамма-спектрометре с полупроводниковым Ge(Li), детектором и программным обеспечением «Аспект» с помощью спектрометрического устройства СУ-03П № 0037-06. Приготовление экспериментальных партий субстанции метилендифосфоновой кислоты с двухвалентным оловом MDP(Sn) проводили в реакционной установке. Расфасованные растворы субстанции во флаконы вместимостью 10 см³ лиофилизовали в сублиматоре Epsilon2-16D.

Качественные и количественные характеристики основного вещества метилендифосфоновой кислоты и вспомогательных веществ определялись спектрофотометрическим методом на спектрофотометре LKB Biochrom Ultrespec II (Швеция). Для определения процентное соотношение образовавшего комплекса  МDP^99mТс, свободного пертехнетат ионов ^99mTcО₄^- и гидролизованного восстановленного технеция (ГВТ) ^99mTcO₂ использовали хроматографическую бумагу  марки ЗММ (Whatman) и хроматографическую пластину с тонким слоем силикагеля (Art. 5553, Merck).

Методика получения субстанции на основе лиганда MDP и восстанавливающего агента Sn²⁺

Экспериментальные партии субстанции MDP(Sn) приготовили в реакционной установке путем растворения в воде для инъекций химических ингредиентов с пропусканием через раствор очищенного инертного газа, аргона со скоростью 5•10^-6 м³/с., после чего, не прекращая подачу аргона, в смесь добавили олово двухлористое в солянокислом растворе. После завершения синтеза, полученный раствор пропустили через мембранный фильтр  размерами пор 0,22 мкм, в установку для розлива по 1 мл во флаконы, вместимостью 10 см³ и лиофилизовали в сублиматоре. После завершения лиофильной сушки, камеру сублиматора заполнили очищенным инертным газом аргона, выгрузили из камеры флаконы с субстанцией и незамедлительно укупорили резиновыми крышками и алюминиевыми колпачками. Этим методом были приготовлены образцы субстанции MDP-Sn с разным содержанием метилендифосфоновой кислоты 7,0-12,0 мг/мл и Sn2+ (0,8-1,15 мг/мл), а также в период приготовлении образцов субстанции pH раствора комплекса изменялся в пределах от 4,0 до7,0.

Методика получения комплекса МDP^99mТс

Для получения комплекса MDP^99mTc в субстанции MDP(Sn) добавили 5 мл раствора натрия пертехнетата (Na^99mTc) получаемый из  генератора технеция-99m. После полного растворения лиофилизат настояли в течение 5 минут и проверяли эффективность образования комплекса MDP^99mTc,  количество образовавшегося комплекса MDP^99mTc, несвязанного в комплекс ^99mTcО₄^- и гидролизованного ^99mTcO₂  опредилили методами бумажной и тонкослойной хроматографии.

Методика хроматографических исследований

а)         На хроматографической бумаге ЗММ (Whatman), размером 15 х 200 мм, отметили линию старта на расстоянии 15 мм от одного из краев и линию фронта, находящуюся на расстоянии 100 мм от линии старта. На линию старта полоски нанесли 0,001 - 0,005 мл раствора препарата. После высушивания пятна на хроматографической бумаге провели хроматографирование восходящим методом до достижения с растворителем, отмеченной линии фронта (ориентировочно 40 мин), используя в качестве растворителя раствор натрия хлорида изотонического 0,9 % для инъекций. В указанном режиме хроматографирования значения Rf гидролизованного ^99mTcO₂ составляет 0,0 ± 0,05, а для комплекса МDP^99mТс и пертехнетат ионов ^99mTcО₄^- составляет 1,0. С полученной хроматограммы измерили скорость счёта от участка, содержащего ГВТ и от всей хроматограммы радиометрическим методом.

б) На полоске хроматографической пластины с тонким слоем силикагеля (Art. 5553, Merck) размером 15x100 мм отметили линию старта на расстоянии 15 мм от одного из краев, и линию фронта, находящуюся на расстоянии 80 мм от линии старта. На линию старта полоски нанесли 0,001 -0,005 мл раствор препарата. После высушивания пятна на хроматографической бумаге провели хроматографирование восходящим методом до достижения с растворителем ацетоном отмеченной линии фронта (ориентировочно 20 мин). В указанном режиме хроматографирования значения Rf ^99mTcО₄^-, составляет 0,95 ± 0,05 и 0,0 для ^99mTcO₂ и МDP^99mТс. С полученной хроматограммы измерили скорость счёта от участка, содержащего свободные пертехнетат-ионы, и от всей хроматограммы радиометрическим методом. Радиохимические примеси в растворе препарата,  вычислили по формуле:

РХП= (∑ ГВТ+  ∑^99mTcO₄^- / ∑А хр)*100%,

где   РХП - Радиохимические примеси в растворе препарата;

∑ ГВТ – сумма скорость счета активности гидролизованного восстановленного технеция,

∑^99mTcО₄ - скорость счета активности свободных пертехнетат-ионов;

∑А хр. – сумма скорости счета активности для всей хроматограммы.

Методика определения стабильности субстанции MDP(Sn)

Метод определения стабильности субстанции MDP(Sn) заключается в следующем: для изучения стабильности субстанции MDP(Sn) отбирается ранее приготовленные субстанции со сроком хранения 3, 6, 9 и 12 месяцев, далее осуществляется мечение этих субстанций радионуклидом ^99mТс, для получения комплекса МDP^99mТс. Критерием стабильности субстанции MDP(Sn) служит сохранению его качества, т.е. внешнего вида, количественного содержания основных веществ и эффективность мечения с радионуклидом ^99mТс.

Результаты и обсуждения

При изучении влиянии концентрации лиганда, Sn²⁺ и рН на эффективность образования комплекса МDP^99mТс в растворах, изменялась в пределах 7,0-12,0 мг/мл, Sn²⁺ 0,8-1,15 мг/мл и 4,0-7,0 соответственно. При минимальном количестве Sn²⁺ (0,8 мг/мл), участвующей в реакции восстановления ^99mTcО₄^-, комплексообразования ^99mTc с метилендифосфоновой кислотой содержанием 7,0 мг/мл и рН раствором 6,0 максимальный уровень связанного ^99mTc  составил  £ 83,7%. Высокий уровень  связывания ^99mTc  с метилендифосфоновой кислотой £ 99,5% наблюдался в субстанциях с количественным содержанием: Sn²⁺ 0,95 мг/мл, с метилендифосфоновой кислотой 10,0 мг/мл и рН раствора 6,0. Полученные результаты приведены в таблице1.

Таблица 1.

Эффективность образования комплекса МDP^99mТс в зависимости от концентрации лиганда, Sn²⁺ и pH раствора комплекса (в процентах), через 20 минут после добавления ^99mTcО₄^- в субстанцию

Из приведенных результатов таблицы 1. видно, что партия субстанции с количественным содержанием метилендифосфоновой кислоты в пределах 10,0-11,0 мг/мл, Sn²⁺ 0,95 мг/мл, и рН раствора 6,0, образует довольно устойчивый комплекс с ^99mTс с эффективностью £ 99,5%.

Увеличение концентрации Sn²⁺ до 1,05 мг/мл  в реакционных смесях не оказывали существенного влияния на характер образования комплексов ^99mTc  с метилендифосфоновой кислотой. Но дальнейшее увеличение концентрации Sn²⁺ в реакционных смесях до 1,15  мг/мл образование комплекса ^99mTc  с бифосфонатом начинается снижаться и это по-видимому, обусловлено тем, что  избыточное количество Sn²⁺ приводит к восстановлении ионов ^99mTcО₄^-  в пертехнетате до более низкой степени окисления технеция.

Чтобы избежать дальнейшего снижения степени окисления ионов пертехнетата до более низкой степени окисления содержание хлорида олова по отношению к добавленной активности не должно быть в избытке.

При изучении скорости процесса образования комплекса МDP^99mТс, в реакционной смеси концентрация Sn²⁺ составляла 0,95 мг/мл, лиганда 10,0 мг/мл и рН раствора было равно 6,0. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Кинетика образования комплекса МDP(Sn)^99mТс в разные промежутки времени

Как видно из результатов в таблице 2, при соотношение концентрации метилендифосфоновой кислоты, к олову 10:0,95 в реакционных смесях комплекс МDP^99mТс образовывался практически мгновенно и их количество оставалось на высоком уровне в течение 5 ч. Высокий уровень ^99mТс связанного с метилендифосфоновой кислотой (99,5±0,4%) наблюдался через 20 мин и сохранялся на этом уровне почти до 1 ч. По истечению 1 ч комплекс начинает гидролизоваться и к 5 ч кондиционное состояние остается 98,1%.

Для изучения стабильности субстанции MDP(Sn) были выбраны ранее приготовленные субстанции со сроком хранения 3, 6, 9 и 12 месяцев с содержанием МDP и Sn2+ 10:0,95 мг/мл с мечением радионуклида ^99mТс  с последующем образованием   комплекса МDP^99mТс и проверены количественные и качественные характеристики комплекса. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Изучения стабильности субстанции MDP(Sn)

Из приведенных данных в таблице 3. показывает, что качество субстанции в течение хранения 12 месяцев незначительно отличается от качества данных на день выработки. Видимо, это объясняется присутствием инертного газа аргона внутри флакона с субстанцией, который предотвращает разложение субстанции и окисление Sn²⁺, тем самым обеспечивает качество в течение 12 месяцев и можно присвоить срок годности для субстанции 12 месяцев.

Заключение

Таким образом, в ходе выполнения работ определены оптимальные соотношения основного вещества метилендифосфоновой кислоты  и восстанавливающего агента (двухвалентного олова), в реакции комплексообразования МDP^99mТс и оптимальные условия мечения метилендифосфоновой кислоты с радионуклидом технеций-99m. Определена устойчивость комплекса метилендифосфоновой кислоты с радионуклидом технеций-99m и установлен предварительный срок хранения субстанции МDP(Sn), которая составляет 12 месяцев.

Список литературы:

1. Subramanian G., McAfee JG. A new complex of  ^99mTc for skeletal imaging// Radiology, 1971,Vol. 99, №.1. P.192-196.
2. Method and reagent for making a radiopharmaceutical composition based on technetium - 99m // European patent application EP  № 0960623A2. 17.02.82 Bulletin 827 /  White L. R.,  Brockas A., Abrahams R., [et al. ].
3. Technical Reports Series No. 466: Vienna, International Atomic Energy Agency.- Technetium-99m radiopharmaceuticals: manufacture of kits. -, 2008, P. 66-69.
4. Kan S.S., Lokhande R.S., Bhagat J.K. Radiolabeling and radiation dosimetry of 99mtczoledronic acid (99mtc-za) for bone scintigraphy// International Journal of Pharmaceutical Research & Analysis , 2017,Vol. 8, №.1. P. 7-12.
5. Motaleb, M.A., Sanad, M.H., Selim, A.A. et al. Synthesis, Characterization, and Radiolabeling of Heterocyclic Bisphosphonate Derivative as a Potential Agent for Bone Imaging// Radiochemistry, 2018, Vol. 60. P. 201-207.
6. Thaer A. New amino bisphosphonate compound for skeletal imaging: Comparison study with methylenediphosphonic acid (MDP) and (1-hydroxyethane-1,1-diyl) diphosphonic acid (HEDP)// J.Nukleonika, 2016, Vol. 61, №.1. P. 69-74.
7. Arun K. T., Rajesh K., Sanjay B., Vasumathi. Quality Assessment of Tc-99m Methylene Diphosphonate (MDP) Radiopharmaceutical Prepared Using Different Cold Kit Fractionation Methods//Indian J. Nucl Med, 2022, Vol. 37, №.1. P.7-11.