ВЫДЕЛЕНИЕ И СКРИНИНГ БАКТЕРИЙ РОДА Bacillus – ПРОДУЦЕНТОВ БИОСУРФАКТАНТОВ

АННОТАЦИЯ

С целью выделения активных штаммов микроорганизмов, продуцентов биосурфактантов, использованы образцы нефте-шламов и замазученных сточных вод Бухарского НПЗ и нефтегазовые скважины Кашкадарьинской области. В результате выделены в чистую культуру 29 штаммов бактерий, относящихся к роду Bacillus. Совокупность данных, полученных при первичном скрининге продукции биосурфактанта показала, что наиболее активными продуцентами биосурфактантов являются штаммы BS H6/4/1 и BS 9/2В. В результате подбора оптимальных источников углерода и азота установлено, что уровень продукции биосурфактанта штаммами BS H6/4/1 и BS 9/2В достигает максимального значения на 48 час культивирования и составляет 1.4 и 0.95 г/л сухого липопептидного биосурфактанта с индексом эмульгирования более 50%. Полученные данные позволяют заключить, что бактерии BS H6/4/1 и BS 9/2В, выделенные из местных нефтезагрязненных субстратов, обладают значительным потенциалом в качестве перспективных продуцентов биосурфактантов для разработки средств биоремедиации нефтезагрязнений.

ABSTRACT

In order to isolate active strains of microorganisms, producers of biosurfactants, oil sludge and smeared wastewater samples of the Bukhara refinery plant and oil-gas wells of Kashkadarya region were used. As a result, 29 strains of bacteria belonging to the genus Bacillus have been isolated in pure culture. The totality of data obtained during the primary screening of biosurfactant production showed that the most active producer strains of biosurfactants are BS H6/4/1 and BS 9/2B. As a result of the selection of optimal sources of carbon and nitrogen, it was found that the level of biosurfactant production by strains BS H6/4/1 and BS 9/2B reaches its maximum value at 48 hours of cultivation and amounts to 1.4 and 0.95 g/l of dry lipopeptide biosurfactant with an emulsification index of more than 50%. The data obtained allow us to conclude that the bacteria BS H6/4/1 and BS 9/2B, isolated from local oil-contaminated substrates, have significant potential as promising producers of biosurfactants for the development of means for bioremediation of oil pollution.

Ключевые слова: Bacillus, штамм, биосурфактант, бактерия, липопептиды, биоремедиация.

Keywords: Bacillus, strain, biosurfactant, bacteria, lipopeptides, bioremediation.

Введение

Поверхностно-активные вещества (ПАВ) представляют собой амфифильные соединения, снижающие поверхностное и межфазное натяжение на границе раздела жидкостей разной полярности [1]. ПАВ используются в качестве чистящих и моющих средств, диспергаторов, увлажнителей, эмульгаторов, при биоремедиации загрязненных нефтью участков [2-4]. Благодаря антимикробной и противовирусной активности, они нашли применение для борьбы с микробной и вирусной инфекцией растений. В ряде исследований показана эффективность применения ПАВ в составе лекарственных препаратов противоопухолевого действия [5, 6]. Большинство ПАВ получают химическим синтезом [7], однако в последнее время их производство стало одним из перспективных направлений развития «зеленых» технологий 21 века [9]. Было доказано, что микробные БС , обладают рядом преимуществ, таких как биоразлагаемость, функционирование в широком диапазоне pH, температуры, устойчивость к высоким концентрациям NaCl, более высокой селективностью и стабильностью, и также проявляют антибактериальную и антифунгальную активность [8]. Вместе с тем, продукция микробных биосурфактантов может проводиться в процессе управляемой ферментации микроорганизмов - продуцентов на относительно простых по составу минеральных средах и доступных источниках углерода. Это позволяет увеличить выход биосурфактантов без значительных материальных и энергетических затрат. Кроме того, микробные продукты более безопасны для окружающей среды по сравнению с химическими ПАВ [10], и могут их заменить во многих областях промышленности [11].

Продуценты биосурфактантов выявлены среди микроорганизмов разных таксономических групп. Так, низкомолекулярные БС гликолипидной природы (рамнолипиды, трегалолипиды, софоролипиды, липопептиды) способны синтезировать бактерии, относящиеся к роду Pseudomonas [10, 12], Acinetobacter [13], Rhodococcus [14], Candida [15] и Bacillus [16]. Биосинтез высокомолекулярных БС (гликопротеины, полисахариды, липопротеины) характерны для бактерий, относящихся к роду Acinetobacter [17, 18]. Одной из наиболее перспективных групп биосурфактантов являются липопептиды, основными продуцентами которых являются бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis [19]. Одним из наиболее известных и перспективных бактериальных биосурфактантов липопептидной природы является сурфактин, представляющий собой циклический липопептид, состоящий из гидрофильного пептидного кольца из семи аминокислот и гидрофобной цепи β-гидроксижирной кислоты длиною в 12–16 атомов углерода. Благодаря своим уникальным биологическим свойствам он широко используется для устранения органических и неорганических загрязнителей при биоремедиации участков, загрязненных нефтью, и в процессе повышения нефтеотдачи микроорганизмами [20].

Целью настоящего исследования является выделение и скрининг из нефтезагрязнённых участков Бухарского и Кашкадарьинского нефтеперерабатывающего предприятий бактерии рода Bacillus эффективных продуцентов биосурфактантов.

Материалы и методы

Для выделения бактерий рода Bacillus, продуцирующих биосурфактанты, использовали нефте-шламы и замазученные сточные воды Бухарского НПЗ и нефтегазовые скважины Кашкадарьинской области. Выделение проводили методом накопительных культур на питательных средах триптон соевый бульон (ТСБ) (HiMedia, Индия) разбавленный в дистиллированной воде в соотношении (1:1) и минеральную среду МСМ (минимальная солевая среда) [21] с 1% нефтью. Колбы инкубировали в течение 6 суток при температуре 30±2 °С на качалке (60 об/мин). Обогащенную культуру высевали на агаризованные среды методом серийных разведений. Чашки инкубировали при 30±2 °С в течение 48-96 часов.

Культивирование чистых штаммов бактерий рода Bacillus проводили на минеральной среде МСМ с глюкозой или глицерином в качестве источников углерода. Штаммы выращивали в пробирках в среде объёмом 5 мл при температуре 30 ^оС в течении 48 час. Культуральную жидкость центрифугировали при 12000 об/мин в течении 15 мин и отбирали супернатант для определения внеклеточных биосурфактантов.

Скрининг на внеклеточную продукцию биосурфактантов проводили по нескольким общепринятым тестам. Тест на растекание нефти проводили в чашке Петри с 20 мл дистиллированной воды, на поверхность которой наносили 5 мл нефти, затем сверху наносили 30 мкл супернатанта. Диаметр прозрачной зоны на поверхности нефти измеряли и сравнивали с отрицательным контролем, в качестве отрицательного контроля служила дистиллированная вода. Тест на CTAB-агаре и гемолитическую активность проводили по методу Госвани и Дека [23]. Индекс эмульгирования (ИЭ), показывающий способность штаммов эмульгировать углеводороды в водной среде, определяли методом Купера и Голденберга [24].

Продукцию биосурфактантов наиболее активных штаммов изучали в динамике роста и развития штаммов в течении 72-96 часов. В качестве инокулята использовали активные штаммы бактерий, предварительно выращенные на ТСБ при 30±2 °C и pH 7,0 в течение 24 ч. В питательной среде МСМ, где в качестве источников углерода использовали глюкозу и глицерин, а источниками азота служили мочевина и NaNO_3. В колбы Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды вносили, 2-4% инокулята, культивирование проводили на круговой качалке при 150 об/мин, при 30 °С, рН 7,0-7,5. Пробы отбирали каждые 24 ч., супернатант отделяли центрифугированием.

Для экстракции биосурфактанта супернатант подкисляли 6Н HCl до рН 2–4, после чего выдерживали 14–18 часов при температуре 4 °C для усиления осаждения биосурфактанта. Осадок отделяли центрифугированием при 12000 об/мин, затем растворяли в 10 мМ фосфатном буфере рН=7,0 и экстрагировали несколько раз равным объёмом смеси хлороформ:метанол в соотношении (2:1). Растворитель удаляли на роторном испарителе при температуре 45 °C. Осадки неочищенных биосурфактантов высушивали при 110 °C в течение 24 часов и взвешивали. В результате был получен неочищенный БС коричневого цвета.

Результаты и их обсуждения

Производство микробных биосурфактантов является дорогостоящим процессом в связи с небольшим выходом продукта, трудоемкостью и сложностью методов их выделения. Улучшение эффективности производства можно достичь за счет применения соответствующего дешевого сырья, оптимизации условий культивирования, подбора оптимальных методов выделения биосурфактантов, и отбора высокоактивных штаммов продуцентов [24, 25].

В качестве субстратов, предполагающих наиболее вероятную заселенность бактериями рода Bacillus, продуцирующими биосурфактанты, нами были использованы нефте-шламы и замазученные сточные воды вышеуказанных предприятий. Выделение бактерий проводили по исходной характеристике (колониальная морфология, окраска по Граму). Всего выделено 29 штамма относящихся к роду Bacillus.

Уровень продукции микробных биосурфактантов существенно зависит от источника углерода. Так, микроорганизмы эффективно синтезируют биосурфактанты при росте на липофильных субстратах, например, углеводородах. Однако, у бактерий рода Bacillus способность использовать углеводороды в качестве источника углерода встречаются крайне редко. В связи с этим, способность бацилл синтезировать биосурфактанты была изучена на среде, где в качестве источника углерода использовали глицерин или глюкозу. Irfan Ali Phulpoto и др. показали, что лучшими углеродно-азотными субстратами для биосинтеза биосурфактанта для штамма Bacillus nealsonii S2MT, являлся 2% глицерин и 0,1% NH₄NO₃ [26]. Исследования по подбору питательной среды, где в качестве источника углерода использовали глицерин, также проведены со штаммом Bacillus subtilis #309, где выход биосурфактанта составил 2,8 г/л [27].

При первичном скрининге штаммов по ИЭ установлено, что практически все 29 выделенных штаммов бактерий синтезировали биосурфактанты на среде МСМ и с глюкозой, и с глицерином. Значение ИЭ на среде с глюкозой варьировало от 25 до 51%, для штаммов BS 9/2А, BS Н5/1/1, BS 7/6/2, BS 10/9, BS N6 значения ИЭ составляло более 40, а максимальный ИЭ наблюдался для штаммов BS 2GD и BS №5 и составил 51.35 и 48.4 % соответственно. При выращивании штаммов на глицерине максимальный ИЭ составил 40% и наблюдался для штаммов BS 9/2Б, BS Н4/1/1, BS Н6/4/2, BS Н6/4/1, BS 2GD, BS 4GD, BS N6 (рис. 1).

Рисунок 1. Скрининг бактерий рода Bacillus на питательной среде с глюкозой и глицерином

Среди бактериальных продуцентов биосурфактантов бактерии рода Bacillus отличаются способностью создавать наиболее низкое межфазное натяжение между углеводородами и водной фазой, что необходимо для мобилизации нефти. При качественном скрининге 29 штаммов с использованием тестов на вытеснение нефти, у 7 штаммов зона вытеснения нефти варьировала от 5 до 30 мм, максимальная зона вытеснения нефти наблюдалась для штаммов BS H6/4/1 и BS 9/2А и составила 30 и 27 мм, соответственно (рис. 2). Следует отметить, что для штамма BS H6/4/1 вытеснение нефти наблюдалось уже через 24 часа культивирования.

Анионные биосурфактанты, взаимодействуя с СТАБ и метиленовым синим, образуют нерастворимую ионную пару, что приводит к образованию синего кольца. В этой связи СТАВ-агар используется при скрининге бактерий на продукцию биосурфактантов. Так, при высеве штаммов на СТАВ-агар зона образования синего кольца составила более 1 мм практически для всех штаммов, для штаммов BS H6/4/2, BS 9/2 А, BS 9/2В, BS 7/6/2, BS 7/8/2 и BS H 4/1/1 зона окрашивания варьировала от 7 до 10 мм, максимальная зона наблюдалась для штамма BS Н6/4/1 и составила 13 мм. Кроме того, при определении гемолитической активности штамма BS Н6/4/1 зона лизиса кровяного агара составила 2,5 см.

Рисунок 2. Скрининг по индексу эмульгирования и анализу вытеснения нефти штаммами бактерий рода Bacillus. BS Н4/1/1, BS 5/1/1, BS 9/2, BS 6/4/1

Таким образом, в результате первичного скрининга нами было отобрано 7 наиболее активных штаммов бактерий, относящихся к роду Bacillus и способных синтезировать биосурфактант.

Продукцию биосурфактанта наиболее активных штаммов изучали в динамике роста и развития в течении 72-96 часов, активные штаммы бактерий выращивали на среде МСМ, где в качестве источника углерода использовали 2% глицерин, а в качестве азота мочевину или NaNO₃.

Экспериментально установлено, что на среде МСМ с 2 % глицерином, где в качестве источника азота использовали мочевину, биосинтез биосурфактанта начинается через 24 часа. Максимальный биосинтез биосурфактанта наблюдался через 48 часов культивирования для штаммов BS H6/4/1, BS H6/4/2, BS 9/2 А и BS 9/2Б с выходом экстрагированного биосурфактанта 1.4, 0.705, 0.95 и 0.87 г/л, соответственно, при биомассе клеток 4.6, 3.5, 1.7 и 2.0 г/л. При этом ИЭ в супернатанте составлял более 50%. В то же время, ИЭ не детектировался в биомассе штаммов BS H6/4/1, BS H6/4/2, BS H4/1/1 ИЭ, тогда как в биомассе штаммов BS 9/2 А и BS 9/2Б в ОК через 72 часа культивирования ИЭ составил 14.2 и 48.1, соответственно (табл.1). Максимальный выход биосурфактанта на среде с глицерином и мочевиной наблюдался через 48 час культивирования для штамма BS H6/4/1, и составил 1.4 г/л с ИЭ более 50%. По литературным данным, штаммы бактерий синтезирующие биосурфактанты, ИЭ которых более 50% считаются хорошими продуцентами биосурфактантов [28]. Через 72 часа культивирования в динамике роста наблюдалось снижение количества бактериальной биомассы и выход биосурфактанта.

Таблица 1.

Биосинтез биосурфактанта на среде с глицерином и мочевиной

Следует отметить, что снижение уровня биомассы после высокой продукции биосурфактанта показано для Virgibacillus salarius (KSA-T) [29] и Pseudomonas aeruginosa AK6U [30]. При использовании в качестве источника азота NaNO₃, значение ИЭ было невысоким по сравнению с мочевиной и не превышало 10 - 18%.

Таким образом, из образцов нефте-шламов и замазученных сточных вод выделены ряд бактерий рода Bacillus, продуцирующие биосурфактанты. В результате подбора оптимальных источников углерода и азота установлено, что уровень продукции биосурфактанта штаммами BS H6/4/1 и BS 9/2В достигает максимального значения на 48 час культивирования и составляет 1.4 и 0.95 г/л сухого липопептидного биосурфактанта с ИЭ более 50%. Полученные данные позволяют заключить, что штаммы бактерии BS H6/4/1 и BS 9/2В, выделенные из местных нефтезагрязненных источников, обладают значительным потенциалом в качестве перспективных продуцентов биосурфактантов для разработки средств биоремедиации нефтезагрязнений.

Список литературы:

1. Kamal M.S. A Review of Gemini Surfactants: Potential Application in Enhanced Oil Recovery // J. Surfactants Deterg. – 2016. –V.19. –P. 223-236.
2. Sar P., Ghosh A., Scarso A., Saha B. Surfactant for better tomorrow: Applied aspect of surfactant aggregates from laboratory to industry. //Res. Chem. Intermed. –2019. –V.45. –P.6021-6041.
3. Tripathy D.B., Mishra A., Clark J., Farmer T. Synthesis, chemistry, physicochemical properties and industrial applications of amino acid surfactants: A review. //Comptes Rendus Chim. –2018. –V.21. –P.112-130.
4. Negin C., Ali S., Xie Q. Most common surfactants employed in chemical enhanced oil recovery. //Petroleum –2017. –V. 3. –P.197-211.
5. Dey G., Bharti R., Sen R., Mandal M. Microbial amphiphiles: a class of promising new-generation anticancer agents. //Drug Discov Today. –2015 –V.20(1) – P.136-46. doi: 10.1016/j.drudis.2014.09.006. Epub 2014 Sep 19.
6. Mandana Ohadi, Arash Shahravan, Negar Dehghannoudeh, Touba Eslaminejad, Ibrahim M Banat, Gholamreza Dehghannoudeh. Potential Use of Microbial Surfactant in Microemulsion Drug Delivery System: A Systematic Review Drug Design //Development and Therapy –2020. –V.14. –P.541-550.
7. Wang J., Nguyen A.V., Farrokhpay S. A critical review of the growth, drainage and collapse of foams. Adv. //Colloid Interface Sci. –2016. –V.228, –P.55-70.
8. Soberón Chávez G. Biosurfactants: From Genes to Applications; Springer: New York, NY, USA, 2010; ISBN 3642144896.
9. Abdullahi Adekilekun Jimoh, Johnson Lin //Biosurfactant: A new frontier for greener technology and environmental sustainability. //Ecotoxic. & Environm. Safety 184 (2019) 109607 https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.109607.
10. Katarzyna Paraszkiewicz, Przemysław Bernat, Anna Kuśmierska, Joanna Chojniak, Grażyna Płaza //J. Environmental Management. –2018. – V. 209,–P. 65-70 https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2017.12.033.
11. Sivasankar P., Suresh Kumar G. Influence of pH on dynamics of microbial enhanced oil recovery processes using biosurfactant producing Pseudomonas putida: Mathematical modelling and numerical simulation. Bioresour. Technol. – 2017. – V. 224. –P. 498-508. doi: 10.1016/j.biortech.2016.10.091.
12. Varjani S.J., Upasani V.N. //Bioresour. Technol. –2017. –V.232, –P.389-397.
13. Ramírez I.M., Tsaousi K., Rudden M., Marchant R., Alameda E.J., Román M.G., Banat I.M. //Bioresour. Technol. –2015. –V.198. –P.231-236.
14. Cappelletti M., Presentato A., Piacenza , Biotechnology of Rhodococcus for the production of valuable compounds. // J. Appl Microbiol Biotechnol. –2020. –104. –P.8567-8594. https://doi.org/10.1007/s00253-020-10861-z
15. Hüsniye T. Yalçın, Gülşah Ergin-Tepebaşı, Ebru Uyar. Isolation and molecular characterization of biosurfactant producing yeasts from the soil samples contaminated with petroleum derivatives //J. Basic Microbiol. –2018. –P.1-11. doi: 10.1002/jobm.201800126.
16. Mamta Rani1, Joel T. Weadge and Suha Jabaji1 Т. Isolation and Characterization of Biosurfactant-Producing Bacteria from Oil Well Batteries with Antimicrobial Activities Against Food-Borne and Plant Pathogens //ORIGINAL RESEARCH published: 27 February 2020 doi: 10.3389/fmicb.2020.00064
17. Mandana Ohadi, Gholamreza Dehghan-Noudeh, Mojtaba Shakibaie, Ibrahim M. Banat, Mostafa Pournamdari, Hamid Forootanfar. Isolation, characterization, and optimization of biosurfactant production by an oil-degrading Acinetobacter junii B6 isolated from an Iranian oil excavation site. //Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.bcab.2017.08.007
18. Bustamante M., Durán N., Diez M. C. Biosurfactants are useful tools for the bioremediation of contaminated soil: a review //J. Soil Science and Plant Nutrition –2012. –V.12 (4). –V. 667-687.
19. Biniarz P., Łukaszewicz M., Janek T. Screening concepts, characterization and structural analysis of microbial-derived bioactive lipopeptides: //A review. Crit. Rev. Biotechnol. – 2017. –V.37. –P. 393-410.
20. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: Structures, syntheses and specific functions. //Mol. Microbiol. –2005. – V.56. – P. 845-857.
21. Janek T., Drzymała K., Dobrowolski A. In vitro efficacy of the lipopeptide biosurfactant surfactin - C 15 and its complexes with divalent counterions to inhibit Candida albicans biofilm and hyphal formation. //Biofouling. –2020. –V. 36. –P 210-221.
22. Wu Y.S., Ngai S.C., Goh B.H., Chan K.G., Lee L.H., Chuah L.H. Anticancer activities of surfactin potential application of nanotechnology assisted surfactin delivery. //Front. Pharmacol. –2017. –V. 8. –P.761.
23. Goswami M., Deka S. Biosurfactant production by a rhizosphere bacteria Bacillus altitudinis MS16 and its promising emulsification and antifungal activity. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019 Jun 1;178:285-296. doi: 10.1016/j.colsurfb.2019.03.003. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30878803.
24. Andr Felipe da Silva, Ibrahim M. Banat, Admir Jos Giachini, Diogo Robl. Fungal biosurfactants, from nature to biotechnological product: bioprospection, production and potential applications. //Bioprocess and Biosystems Engineering 2021 https://doi.org/10.1007/s00449-021-02597-5
25. Cooper D.G., Goldenberg B.G. // J. App. Environ. Microbiol. –1987. –V.53. –N.2. –P. 224-233.
26. Irfan Ali Phulpoto, Zhisheng Yu, Bowen Hu, Yanfen Wang, Fabrice Ndayisenga, Jinmei Li, Hongxia Liang and Muneer Ahmed Qazi. Production and characterization of surfactin‑like biosurfactant produced by novel strain Bacillus nealsonii S2MT and it’spotential for oil contaminated soil remediation. // Microb Cell Fact. –2020. –V.19. –P.145. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01402-4.
27. Pereira J.F.B., Gudiña E.J., Costa R., Vitorino R., Teixeira J.A., Coutinho J.A.P., Rodrigues L.R. Optimization and characterization of biosurfactant production by Bacillus subtilis isolates towards microbial enhanced oil recovery applications. //Fuel. –2013. –V.111. –P. 259-268.
28. Tomasz Janek, Eduardo J. Gudiña, Xymena Połomska, Piotr Biniarz, Dominika Jama, Lígia R. Rodrigues, Waldemar Rymowicz, Zbigniew Lazar Sustainable Surfactin Production by Bacillus subtilis Using Crude Glycerol from Different Wastes //Molecules. – 2021. – V.26. – P. 3488. https://doi.org/10.3390/molecules26123488.
29. Elazzazy A.M., Abdelmoneim T.S., Almaghrabi O.A. Isolation and characterization of biosurfactant production under extreme environmental conditions by alkali-halo-thermophilic bacteria from Saudi Arabia. Saudi //J. Biol. Sci. – 2015. – V.22. – P.466-475.
30. Ismail W., Shammary S.A.L., El-Sayed W.S., Obuekwe C., El Nayal A.M., Raheem A.S.A., Al-Humam A. Stimulation of rhamnolipid biosurfactants production in Pseudomonas aeruginosa AK6U by organosulfur compounds provided as sulfur sources. // Biotechnol. – 2015.– V.7. – P.55-63.