ВЫДЕЛЕНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

АННОТАЦИЯ

Объектом исследования являлись вновь выделенные штаммы Lactobacillus. Изучены морфолог-окультуральные, физиолого-биохимические и свойства 5 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из объектов природного происхождения. Проведена идентификация выделенных штаммов молочнокислых бактерий по результатам проведённых исследований вновь выделенные штаммы молочнокислых бактерий были отнесены к Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei. Проведен качественный тест на каталазную и амилазную активность и разжиженние желатина, а также ферментирование углеводов.

ABSTRACT

The object of the study was newly isolated strains of Lactobacillus,. The morphological-cultural, physiological-biochemical and properties of 5 strains of lactic acid bacteria isolated from objects of natural origin were studied. Based on the results of the studies, the isolated strains of lactic acid bacteria were identified and the newly isolated strains of lactic acid bacteria were assigned to Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei. A qualitative test was carried out for catalase and amylase activity and gelatin liquefaction, as well as carbohydrate fermentation.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии рода Lactobacillus, морфолого культуральные физиолого-биохимические свойства, ферментирование углеводов

Keywords: lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus, morphological, cultural, physiological and biochemical properties, fermentation of carbohydrates

Поиск новых перспективных штаммов-пробиотиков, их характеристика, а также изучение уже известных пробиотических штаммов является важной и актуальной задачей фундаментальной науки. [1]. Исследования направленные на поиск и изучение новых штаммов молочнокислых микроорганизмов, распространены и актуальны во всем мире [2,3,4]. .Лактобациллы являются одним из наиболее изучаемых представителей группы молочнокислых бактерий наряду со стрептококками, лактококками и энтерококками. Согласно современной филогенетической классификации бактерий род Lactobacillus имеет более ста пятидесяти видов и подвидов. [5]. Авторами [6]. проведены исследования 10 штаммов Lactobacillus которые обладали более высокой антиоксидантной и агрегационной активностью. Эти штаммы имели длинные клетки более чувствительные к кислоте и желчи. [6]. Авторы исследовали изоляты лактобацилл из фекалий самцов крыс линии Вистар. На основании морфологических и биохимических характеристик отобраны четыре потенциальных пробиотических изолята (CS2, CS3, CS4 и CS7). Изоляты CS4 и CS7 проявляли сильную антибактериальную активность против патогенов. Все изоляты лактобацилл были чувствительны ко всем тестируемым антибиотикам, кроме ванкомицина. [7]. В работах исследователей идентифицированы 14 изолятов молочнокислых бактерий с помощью секвенирования гена 16S рРНК и установлены как Enterococcus mediterraneensis, Lactobacillus fermentum и Streptococcus lutetiensis. Определен пробиотический потенциал изолятов. [8]. В работах авторов изучена антибактериальную активность и пробиотические свойства Lactobacillus и Bifidobacterium spp, эти штаммы выдерживали 0,3% соли желчных кислот в течение 4 ч. Все испытанные штаммы были чувствительны к ампициллину. [9]. В исследованиях проведен таксономический анализ каротинсинтезирующего штамма Bacillus sp.. На основании нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и профиля полиморфных нуклеотидов штамм был отнесен к виду Bacillus amyloliquefaciens. [10,11,12]. Исследователи провели работы с вновь выделенными штаммами с технологически ценными свойствами для получения ферментированного молочного продукта с заданными характеристиками не утрачивает своей актуальности [13, 14, 15]. Проводились работы по выделению перспективных штаммов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus которые использовали для создания бактериальных заквасок и бактериальных концентратов при производстве ферментируемых молочных продуктов [16, 17].

 В связи с актуальностью, задачей проводимых исследований было выделение перспективных новых штаммов молочнокислых бактерий для включения их в состав бактериальных заквасок, используемых при производстве ферментируемых молочных продуктов для спортивного питания.

Объектами для выделения служили молочнокислые бактерии изолированые с помощью методов классической микробиологии из фруктов, овощей, молочнокислых продуктов использующихся на территории Узбекистана и стран ближнего зарубежья. Образцы измельчали, затем помещали в МРС бульон и культивировали при 37^оС 48 часов для обогащения.

Из обогащенного бульона готовили серийные разведения и засевали сплошным газоном на МРС агар по 2 чашки на каждое разведение. 1 чашку из 2 повторности помещали в термостат в аэробных условиях культивирования, вторую – в анаэростат, где воздух заменяли газообразным азотом (в анаэробных условиях). Культивировали чашки при 37^оС 48 часов. Культивирование лактобацилл проводили на селективной питательной среде для лактобацилл МРС (Hi-media, Индия) и обезжиренном молоке при 37-40⁰С в аэробных и анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Для создания анаэробных условий использовали анаэростат (Schnett-biotech GmbH, Германия). Идентификация выделенных штаммов проводилась по морфолого культуральным и физиолого-биохимическим свойствам по показателям, указанным в «Определителе Берджи» [18], масспектрофотометра MALDI-TOF. В работе использовали стандартные методические указания и общепринятые методы микробиологического анализа [19, 20, 21].

В результате исследований первоначально отобраны 16 штаммов. Для дальнейшей работы были выбраны 5 штаммов, которые согласно определителю «Берджи» и MALDI-TOF были отнесены к следующим видам Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei. У выделенных культур исследовали морфолого культуральные особенности (внешний вид колоний, размер, цвет) и на физиолого биохимические свойства (каталазная, желатиназная, амилазная активность, сбраживание углеводов).

Таблица 1.

Морфология молочнокислых культур

Рисунок 1. Микроскопический вид (А- Lactobacillus plantarum G1,
Б-Lactobacillus plantarum G2 , В- Lactobacillus brevis G1, Г-Lactobacillus brevis G2 , Д-Lactobacillus paracasei)

Известно, что для использования в производстве молочнокислые бактерии имеют определенные свойства. Штаммы молочнокислых бактерий не должны продуцировать ферменты, относящиеся к факторам патогенности например каталазу и др. Проведенный качественный тест на каталазную активность показал, что отобранные молочнокислые бактерии не обладали каталазной активностью. Также культуры Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei не разжижали желатин и не проявили амилазную активность. Ферментирование углеводов являются важнейшими характеристиками при установлении видовой принадлежности культур. Все молочнокислые бактерии используют углеводы в качестве энергии с последующим образованием молочной кислоты. Было изучено отношение указанных культур к 10 источникам углевода. Наблюдения за изменением кислотности (понижением рН питательной среды), т.е. положительной реакцией, по изменению цвета за счет осветления индикатора в кислой среде, вели ежедневно в течение 7 суток. Результаты по ферментации углеводов лактобактериями Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei приведены в таблице 2. Как показывают результаты, приведенные в таблице, культура Lactobacillus plantarum G1 интенсивно сбраживала L-арабинозу, целлобиозу, галактозу, сахарозу и рамнозу уже в первые 24-48 часов культивирования при 37°С. Культура не сбраживала лактозу, мальтозу, раффинозуи манитол.

В таких же условиях Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei интенсивно ферментировали галактозу, лактозу, мальтозу, а также арабинозу, сахарозу, целлобиозу, мелибиозу. За исключением мелибиозу и манитол культура Lactobacillus paracasei не сбраживала. Lactobacillus plantarum G1 не сбраживал лактозу, мальтозу, манитол. Все исследуемые культуры не сбраживали углевод рафинозу.

Таблица 2.

Ферментация углеводов штаммами рода Lactobacillus

В таких же условиях Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei интенсивно ферментировали галактозу, лактозу, мальтозу, а также арабинозу, сахарозу, целлобиозу, мелибиозу. За исключением мелибиозу и манитол культура Lactobacillus paracasei не сбраживала. Lactobacillus plantarum G1 не сбраживал лактозу, мальтозу, манитол. Все исследуемые культуры не сбраживали углевод рафинозу.

Рисунок 2. Ферментация углеводов молочнокислые бактерии
(А- Lactobacillus plantarum G1, Б-Lactobacillus plantarum G2 , В- Lactobacillus brevis G1, Г-Lactobacillus brevis G2 , Д-Lactobacillus paracasei)

В результате проведенных исследований из природных источников и молочных продуктов выделены молочнокислые бактерии изучены морфолого-культуральные свойства и установлено их систематическое положение. Отмечено, что культуры Lactobacillus plantarum G1, Lactobacillus plantarum G2, Lactobacillus brevis G1, Lactobacillus brevis G2, Lactobacillus paracasei не разжижали желатин и не проявляли каталазную и амилазную активность. Интенсивно ферментировали галактозу, лактозу, мальтозу, а также арабинозу, сахарозу, целлобиозу и мелибиозу.

Список литературы:

1. Дисс. на соискание ученой степени канд. Биол. наук, Цапиева А. Н. Санкт-Петербург 2020
2. Yu, J. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional pickles in Sichuan, China / J. Yu, W. Gao, M. Qing, Z. Sun, W. Wang, W. Liu, L. Pan, T. Sun, H. Wang, N. Bai, H. Zhang // The journal of general and applied
3. Алешкин, А.В. Поликомпонентные пробиотические препараты – конструирование, производство и стратегия их продвижения на российском фармацевтическом рынке: автореф. дис. … д-ра мед. наук: 03.01.06, 03.02.03 / Алешкин Андрей Владимирович. - М., 2011. - 47 с. microbiology. - 2012. - Vol. 58, № 3. - P. 163172
4. Kuda, T. In vitro cholesterol-lowering properties of Lactobacillus plantarum AN6 isolated from aji-narezushi / T. Kuda, T. Yazaki, M. Ono, H. Takahashi, B. Kimura // Letters in Applied Microbiology. - 2013. - Vol. 57, № 3. - P. 187-192.
5. Kaewnopparat, S. In vitro probiotic properties of Lactobacillus fermentum SK5 isolated from vagina of a healthy woman / S. Kaewnopparat, N. Dangmanee, N. Kaewnopparat, T. Srichana, M. Chulasiri, S. Settharaksa // Anaerobe. - 2013. - V. 22. - P. 6-13.
6. Shadi Rajab ¹, Fatemeh Tabandeh ², Mahvash Khodabandeh Shahraky ³, Samira Alahyaribeik ⁴ The effect of lactobacillus cell size on its probiotic characteristics Anaerobe 2020 Apr;62:102103.
7. Prasant Kumar Jena ¹, Disha Trivedi, Kirati Thakore, Harshita Chaudhary, Sib Sankar Giri, Sriram Seshadri Isolation and characterization of probiotic properties of Lactobacilli isolated from rat fecal microbiota Microbiol Immunol. 2013 Jun;57(6):407-16.
8. Al-Shimaa Ibrahim Ahmed ¹, Gihan Mohamed El Moghazy ¹, Tarek Ragab Elsayed ², Hanan Abdel Latif Goda ³, Galal Mahmoud Khalafalla ² Molecular identification and in vitro evaluation of probiotic functional properties of some Egyptian lactic acid bacteria and yeasts J Genet Eng Biotechnol 2021 Aug 5;19(1):114.
9. Dalia Cizeikiene ¹, Jolita Jagelaviciute ² Investigation of Antibacterial Activity and Probiotic Properties of Strains Belonging to Lactobacillus and Bifidobacterium Genera for Their Potential Application in Functional Food and Feed Products Probiotics Antimicrob Proteins 2021 Oct;13(5):1387-1403.
10. O O Nechypurenko, M A Kharhota, L B Zelena, A M Ostapchuk, L V Avdeeva Polyphasic Taxonomic Analysis of Carotene-Synthesizing Strain Bacillus sp. 1.1, Perspective for the Creation of Probiotic] Mikrobiol Z May-Jun 2016;78(3):36-44.
11. Ганина, В. И. Производство заквасок в России / В. И. Ганина, С. А. Фильчакова // Переработка молока. – 2018. – №3. – С. 38–41.
12. Бояринева, И. В. Криоконсервирование бактериального концентрата симбиотической закваски для хлебопекарного производства / И. В. Бояринева, И. С. Хамагаева, А. С. Столярова, Ю. Г. Калужских // Ползуновский вестник. – 2016. – №3. – С. 13–17.
13. Каган, Я. Р. Каталог бактериальных препаратов и заквасок, реализуемых в РФ на рынке ингредиентов, необходимых при производстве сыров / Я. Р. Каган, А. Н. Иркитова – Барнаул: ГНУ СибНИИС Россельхозакадемии, 2010. – 84 с.
14. Орлова, Т. Н. Выделение молочнокислых бактерий из объектов природного происхождения и отбор среди них штаммов, наиболее перспективных для создания бактериальных заквасок и концентратов / Т. Н. Орлова, А. Н. Иркитова // Сб. ст. конф.: «Биотехнология и общество в XXI веке». – Барнаул: Изд-во АлтГУ. – 2015. – С. 232–235.
15. Орлова, Т. Н. Изучение молочнокислых бактерий, выделенных из природных источников / Т. Н. Орлова, Р. В. Дорофеев, Г. С. Мещерякова // Сыроделие и маслоделие. – 2018. – № 2. – С. 36-37
16. Соловьёва, И. В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus. Общая биология / И. В. Соловьёва, А. Г. Точилина, Н. А. Новикова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2010. – № 2 (2). – С. 462–468.
17. Бахнова, Н. В. Заквасочные культуры для производства сыров и кисломолочных продуктов / Н. В. Бахнова // Переработка молока. – 2012. – № 2. – С. 36–38
18. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes - Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA. – 2009. – 1422 р.
19. МУ ВНИИМС 01.86.02.-89 Методические указания по селекции молочнокислых бактерий в состав заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. – Углич: ВНИИМС, 1989. – 87 с.
20. МР 2.3.2.2327-08 Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов). – Углич: ГНУ ВНИИМС, 2008. – 243 с.
21. ОФС.1.7.2.0012.15 Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков. 2015г.