ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ. РИБОНУКЛЕАЗЫ КАК АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ БОРЬБЫ С ВИРУСАМИ

АННОТАЦИЯ

Бактериальные РНК-азы являются перспективными биотехнологическими основами для создания лечебных и профилактических противовирусных препаратов. В данной статье изучено влияние условий культивирования B. thuringiensis, рибонуклеазы которого обладают активностью подавлять размножение вирусов гриппа А/H3N2 и А/H5N1 на суммарный выход Рибонуклеаз

ABSTRACT

Bacterial RNА-ses are promising technological bases for the creation of therapeutic and preventive antiviral drugs. In this article, the influence of the cultivation conditions of B. thuringiensis, whose ribonucleases have the activity to suppress the reproduction of influenza A/H3N2 and A/H5N1 viruses on the total yield of Ribonucleases, is studied.

Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, РНКазы, питательные среды, противовирусная активность, биотехнологическая перспектива.

Keywords: Bacillus thuringiensis, RNases, nutrient media, antiviral activity, biotechnological perspective

На данный момент перед наукой стоят важные задачи, одной из которых является борьба с вирусными заболеваниями, в частности с вирусом гриппа и вирусом Covid-19. Вне зависимости от локальных успехов, лечение данных инфекцией остается довольно сложной проблемой. Причины проблем с лечением и профилактикой данных инфекций, является высокая частота мутаций, краткий период сохранения иммунного ответа на данные инфекции, 

высокое распространение вируса. Все эти факторы ответственны за то, что новые действующие препараты быстро теряют свою эффективность.

В связи с вышеперечисленными факторами, идет форсирование и расширение поиска тех биологически активных веществ, которые обладают противовирусным действием. Среди перечня данных веществ особый интерес занимает РНК-азы.

Рибонуклеазы (РНК-азы) – это ферменты – нуклеазы, отвечающие за деградацию Рибонуклеиновой кислоты (РНК).  РНК-аз участвуют в основных процессах регуляции жизнедеятельности, к примеру участвует в репликации, транскрипции, трансляции, а особенно в процессинге, ведь невозможно созревание РНК, без реакций деградаци. По месту нахождения наиболее яркий интерес вызывают РНК-азы, влияющие на клетку извне.  Именно такие нуклеазы имеют потенциал применения в медицине не только в отношении противовирусной активности, но и как противоопухолевой. Можно выделить основные типы РНК-аз, обладающих противовирусной активностью [1, стр. 107].

Таблица 1.

Типы и действие рибонуклеаз

Однако использование РНК-аз млекопитающих зачастую не эффективно, так как специфический ингибитор, находящийся во всех клетках и тканях и необходимый для защиты от собственных РНК-аз, блокирует активность РНКаз. Но используя РНК-азы бактериального происхождения ингибитор действовать не будет. В связи с этим особый интерес проявляется к внеклеточным РНК-азам, секретируемые у бацилл, в том числе и у Bacillus thuringiensis. Так к примеру: у эндорибонуклеазы бактерии видa B. intermedins зафиксирована эффективность против вируса гриппа А (H1N1) [2, стр. 710].

Методы и материалы

Для проведения исследований были использованы бактерии вида B. thuringiensis, штамма В388 из коллекции бактерий и грибов АРУ им. К. Жубанова. Культивирование бактерий проводили на лизогенной среде LB и на среде КХПГ. Состав среды LB: триптон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; натрия хлорид - 5,0 г/л; бактериологический агар - 15,0 г/л;(bacto agar “Typ USA”, FERAK Berlin), pH среды 7,0 ± 0,2, состав среды КХПГ: Кормовые дрожжи (ВВК) – 15 г/л, хлористый кальций - 0,5 г/л, Пропинол Б400 - 1,0г/л, добавлением глицерин – 5,0, Na2HPO4 – 0,04, CaCl2 – 0,01, MgSO4×7H2O – 0,03. Суспензию бактериальных клеток вносили в количестве 1% вколбы объемом 500 мл с 50 мл среды, нкубировали при t^о - 28-30°С, течение 18-24 ч. при пассивной аэрации 6 ч.

Определение активности РНК-аз

В первую очередь центрифугировали пробы культуральной жидности при 3000 об/мин в течении 1 ч. используя центрифуги модели «LCM 3000». Супернатант очищали, используя ацетат целлюлозные фильтры, с диаметром пор 0,45 мкм (ФМАЦ-0,45 мкм). Хранения осуществляли при температуре -20^оС, -25^оС. Само определение активности РНК-аз определялось по количеству образующихся продуктов расщепления РНК дрожжей. За единицу активности фермента брали его количество катализирующее образование 1 А₂₆₀  продуктов в течении одного часа.

Результат

Сравнение роста Bacillus thuringiensis на среде LB и среде КХПГ

Используя две разные среды, мы наблюдали следующее, что при одинаковых условиях культивирования, на разных средах, наблюдается разная морфология клеток.

Рисунок 1. Морфология клеток B. thuringiensis, штамма В388 на разных средах

На обеих средах бактерии находятся в вегетативном состоянии. Но на среде КХПГ из-за добавления глицерина, хорошо заметны внутриклеточные запасные вакуоли с образованием выраженных для данных штаммов капсул. На среде LB капсулы менее выражены.

(Среда LB)                                                       (среда КХПГ)

Диаграмма 1. Активность РНК-аз в культуральной жидкости

Определение активность фермента Рибонкуклеазы у B. thuringiensis, штамма В388. Культивирование происходило на разных средах, но в одинаковых условиях. Из представленного графика вижно что на среде КХПГ, накопление фермента заняло более длительное время, однако максимальное число содержащегося фермента доходило до 385-400 е.а./ мл. В течении почти 60 часов.  Однако на среде LB максимальное количество фермента было уже через 18-20 часов, но число максимального содержания отличилось на порядок – 40-43 е.а./мл. Также можем отметить, что на 18-20 ч. культивирования активность РНК-аз были сопоставимы.

Выводы.

Стоит включить во внимание, то, что бактерии рода Bacillus, представляют огромный биотехнологический потенциал. В связи с этим полностью целесообразно следует продолжать исследования Рибонуклеаз бацилл.  Также можем отметить следующее, что РНК-азы B. thuringiensis, исследованы недостаточно, но и было показано, что внеклеточные РНК-аза B. thuringiensis, а точнее ее первичная структура является гомологом Биназы (BS – РНКаза). Противовирусная активность препаратов, полученных на основе культуральной жидкости (КЖ) штаммов Bt, наряду с отсутствующей или незначительной токсичностью, делает перспективной дальнейшую их разработку в целях борьбы с вирусами гриппа человека и птиц.

Список литературы:

1. Прунтова О.В., Сахно О.Н., Мазиров М.А. Курс лекций по общей микробиологии и основам вирусологии/ Прунтова О.В., Сахно О.Н., Мазиров М.А./ Владимир - 2006 г., стр. 87-98, стр. 107-131
2. Ильинская О.Н., Шах Махмуд М. Рибонуклеазы как противовирусные агенты // Молекуляр. биология. – 2014, №5.- С. 707-717.