ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЗНАЧЕНИЯХ pН

АННОТАЦИЯ

Изучалось влияние различных значений рН на изменение активности амилазы слюны. Исследование проводили in vitro, в работе использовали слюну, крахмал и раствор соляной кислоты. Сделано заключение, что наибольшая активность амилазы проявляется в диапазоне рН от 5 до 7. Со снижением рН ниже 5, отмечается выраженное понижение амилолитической активности. С уменьшением же рН до 3 проявляется минимальная активность слюнной амилазы, а при рН 2 она полностью отсутствует. Кроме того изменение рН в пределах от 3 до 7 влияет на интенсивность гидролиза крахмала. Также как и модификация активности амилазы слюны при изменении рН отмечается более выраженная интенсивность гидролиза с большим образованием гидролизованного крахмала в диапазоне от 5 до 7. Помимо этого при снижении рН меньше 5 уменьшается интенсивность гидролиза и образование гидролизованного крахмала, которое понижается до рН 3 и отсутствует при рН 2. Снижение рН с 5 до 3  способствует не только уменьшению активности амилазы слюны, но также снижению интенсивности  гидролиза крахмала.

ABSTRACT

The effect of various pH values on the change in salivary amylase activity was studied. The study was carried out in vitro, saliva, starch and hydrochloric acid solution were used in the work. It was concluded that the highest amylase activity is manifested in the pH range from 5 to 7. With a decrease in pH below 5, a pronounced decrease in amylolytic activity is noted. With a decrease in pH to 3, the activity of salivary amylase is minimal, and at pH 2 it is completely absent. In addition, a change in pH in the range from 3 to 7 affects the intensity of starch hydrolysis. As well as the modification of salivary amylase activity, with a change in pH, a more pronounced intensity of hydrolysis is noted with a greater formation of hydrolyzed starch in the range from 5 to 7. In addition, when the pH drops below 5, the intensity of hydrolysis decreases and the formation of hydrolyzed starch decreases to pH 3 and is absent at pH 2. Reducing the pH from 5 to 3 contributes not only to a decrease in the activity of salivary amylase, but also to a decrease in the intensity of starch hydrolysis.

Ключевые слова: растворы крахмала, амилаза слюны, изменение рН, амилолитическая активность, гидролиз, продолжительность инкубации.

Keywords: starch solutions, salivary amylase, pH change, amylolytic activity, hydrolysis, incubation time.

Роль α-амилазы слюны (HSA) в переваривании крахмала часто упускают из виду в пользу роли α-амилазы поджелудочной железы из-за короткой продолжительности оральной фазы. Хотя общепризнанно, что амилаза слюнного происхождения может оставаться активной в желудке, исследования, подтверждающие ее роль, отсутствуют. Выявлено, что амилолитическая активность слюны играет преобладающую роль, гидролизуя до 80% хлебного крахмала в первые 30 мин желудочного пищеварения. Амилолиз развивался экспоненциально, и были получены почти совпадающие кривые независимо от профилей подкисления, что свидетельствует о его высокой эффективности [5,  12].

Предполагается, что HSA может продолжать гидролизовать крахмал в желудке  [3, 1],  до тех пор, пока рН не опустится ниже 4,0 и фермент не будет инактивирован [6,  9].  Поскольку постпрандиальное подкисление желудка является постепенным процессом, для достижения этого уровня pH может потребоваться более 45 минут [10,  4].  Данные исследований на людях, показывают, что HSA после короткой пероральной фазы, может оставаться активной в желудке в течение длительного времени и даже достигать тонкой кишки, не становясь неактивной, где продолжается гидролиз крахмала  [5].  Кроме того сообщается о результатах исследования на людях, что до 76% крахмала в пюре и 59% в хлебе гидролизуются в мальтозу с помощью HSA в желудке [2,   7].   Поскольку никакой другой амилазы нет, только фермент слюнного происхождения может быть ответственен за ферментативный гидролиз крахмала во время желудочного пищеварения [3, 4]. 

Недавнее  исследование показало, что до 80% крахмала гидролизуется in vitro HSA человека в течение 90 минут при постепенном снижении pH с 6 до 2 [5]. Аналогично ли происходит расщепление крахмала в сопоставимых условиях желудка неизвестно, поскольку об этом ферменте известно недостаточно. Было показано, что HSA наиболее активна при pH 7,8 и что в желудке. HSA в основном гидролизует крахмал при значениях pH выше 5 и, следовательно, вклад желудочного пищеварения в расщепление крахмала in vivo будет сильно зависеть от градиента рН в желудке.  Предполагается, что рН желудочного сока остается выше 5 в течение как минимум одного часа  [11, 8]. 

Цель исследования: изучить влияние различных значений рН на изменение активности амилазы слюны.

Материал и методы. В работе in vitro изучалось изменение амилолитической активности слюны при различных значениях рН (от 2 до 7) при использовании в качестве субстрата раствора крахмала. Выявляли количество крахмала, расщепляемого амилазой, которое определялось по изменению интенсивности синего окрашивания крахмала в присутствии йода фотометрическим методом на КФК-3 (производство Россия). Для определения зависимости активности амилазы от различных значений рН вычисляли результат активности амилазы в процентах относительно максимального его показателя. Кроме того определяли степень увеличения гидролиза крахмала по продолжительности действия амилазы слюны  (10, 20, 30 мин) на крахмал при различных значениях рН. Так же путем  выявления количества крахмала, расщепляемого амилазой, по изменению интенсивности синего окрашивания крахмала в присутствии йода фотометрически. При этом рассчитывался в процентах показатель гидролизованного крахмала по разнице результата интенсивности окрашивания крахмала без присутствия слюнной амилазы и показателя интенсивности окрашивания крахмала в присутствия слюнной амилазы по отношению к результату интенсивности окрашивания крахмала без присутствия слюнной амилазы.

Результаты. В результате проведенных исследований влияния различных значениях рН на амилолитическую активность слюны,  было выявлено, что при значении рН 7 отмечалось проявление активности слюнной амилазы равное 92±7,8 % по отношению к максимальному показателю 100 % при рН равному 6,5.   То есть  при этом значении рН отмечалось не значительное снижение активности амилазы по отношению к её максимуму (Рис. 1). 

Рисунок 1. Изменение активности амилазы слюны при различных значениях  рН, в % от максимальной активности

*  - достоверно отличающиеся величины по отношению к показателям максимальной активности.

Однако  при значении рН 6  показатель  активности амилазы  был  равен    95±8,3 %,    что  находилось не   существенно  ниже     по отношению к максимальному показателю 100 % при рН равном 6,5. При значении рН 5,5 отмечалось выраженное, но не достоверное понижение амилолитической активности по отношению к максимальному показателю, которое было равно 84±7,2 % (Рис. 1). Подобные изменения активности амилазы отмечались и при рН 5, которые проявлялись в дальнейшем не достоверном понижении значений активности амилазы, при величине её показателя 77±6,4 %, по отношению к максимальному значению. В тоже время, при рН 4,5 отмечалось достоверное понижение активности амилазы с результатом равном 62±5,3 %, по отношению к максимальному её значению (Рис. 1). Аналогичные изменения активности амилазы отмечались при рН 4, которые   выражались в дальнейшем снижении активности амилазы равном 39±2,8 %. Эта тенденция достоверного снижения активности амилазы по отношению к максимальному значению продолжалась и при рН 3,5 с показателем 21±1,6 %.   Тем не менее, при рН 3 отмечалась минимальное значение активности амилазы равное 5±0,3 %, а при рН 2,5 и 2 активность амилазы практически не изменялась, её показатели были в пределах ошибки метода (Рис. 1).

По результатам исследования интенсивности гидролиза крахмала или зависимости от продолжительности действия амилазы слюны (10, 20, 30 мин) на крахмал при различных значениях рН были получены следующие данные (Рис. 2). Так при рН 7 и инкубации крахмала со слюнной амилазой в течении 10 мин процентный показатель гидролизованного крахмала был равен 54±4,3 %, который увеличивался не достоверно при 20 мин инкубации до 66±5,9 % и далее при 30 мин инкубации крахмала достоверно возрастал до 75±6,2 %. Что показывает на пропорциональное нарастании гидролизованного крахмала с увеличением времени инкубации крахмала со слюнной амилазой (Рис. 2). Подобная динамика, но на меньшем уровне показателей изменения интенсивности гидролиза крахмала, в зависимости от продолжительности действия амилазы слюны была выявлена при рН 6. Когда при 10 мин. инкубации    показатель гидролизованного крахмала  был  равен  59±4,8 %, а при 20 мин инкубации был не достоверно выше по отношению к 10 мин инкубации и составлял 69±6,1 %. В тоже время  при 30 мин инкубации был достоверно выше по отношению к 10 мин инкубации и составлял  81±7,5 % (Рис. 2). Однако при рН 5 динамика изменения интенсивности гидролиза крахмала в зависимости от продолжительности действия амилазы слюны была количественно менее выраженной, чем при рН от 6 до 7.  

Рисунок 2. Изменение показателей продолжительности гидролиза крахмала под влиянием амилазы слюны при различных значениях рН

*  - достоверно отличающиеся величины по отношению к показателям минимальной продолжительности инкубации 10 мин.

Показатель    интенсивности   гидролиза крахмала при 10 мин инкубации его со слюной составлял 48±3,5%, а  при 20 мин инкубации - 53±4,6 % и 30 мин инкубации - 58±4,9 %, что было не достоверно выше по отношению к 10 мин инкубации, и вся динамика изменений свидетельствовала о меньшей интенсивности гидролиза крахмала во времени (Рис. 2). 

При рН 4 отмечена похожая динамика изменений, как и при рН 5, однако с мене выраженными показателями, чем при рН от 5 до7. При этом показатель   интенсивности гидролиза крахмала при 10 мин инкубации его со слюной составлял 22±1,5 %, а  при 20 мин инкубации - 25±1,7 % и 30 мин инкубации - 27±2,2 %, что было не достоверно выше по отношению к 10 мин инкубации и указывало на меньшую интенсивность нарастания гидролиза крахмала во времени. Тем не менее, при рН 3 отмечены самые минимальные количественные показатели   гидролиза крахмала и интенсивности гидролиза крахмала. Результат интенсивности гидролиза крахмала при 10 мин инкубации составил 7±0,4 %, при  20 мин инкубации - 9±0,6 % и при 30 мин инкубации - 10±0,8 %, что было не существенно  выше по отношению к 10 мин инкубации и указывало на незначительную интенсивность нарастания гидролиза крахмала во времени. При этом при рН 2 отсутствовали, какие либо, как количественные, так и динамические изменения показателей гидролиза крахмала (Рис. 2).

Обсуждение результатов. Полученные результаты этих исследований  показали, что наибольшее проявление активности слюнной амилазы отмечается при значениях рН 7, а также 6,5 и 6. В тоже время  при значении рН 5,5 и 5 отмечалось выраженное, но не достоверное снижение активности амилазы по отношению к максимальному её значению. При этом, когда значения рН были равны 4,5 и 4 наблюдалось дальнейшее достоверное снижение активности амилазы по отношению к максимальному её значению. При рН 3,5 сохранялась амилолитическая активность достоверно на низком уровне, а при рН 3 была не существенно выражена, при рН 2,5 и 2 полностью отсутствовала. Все это указывает на то, что амилолитическая активность в желудке может сохраняться в диапазоне рН от 7 до 3. Из результатов проведенных исследований продолжительности действия на крахмал амилазы слюны в течение 10, 20. и 30 мин при различных рН было установлено, что при рН 7 отмечается пропорциональное увеличение гидролизованного крахмала с увеличением продолжительности времени инкубации крахмала со слюнной амилазой. Подобные изменения выявлены и при рН 6. Помимо этого, при рН 5 отмечалось менее выраженное нарастание гидролизованного крахмала с увеличением времени инкубации крахмала со слюнной амилазой. Похожие изменения, но с менее выраженным увеличением гидролизованного крахмала были выявлены при рН 4. Также было установлено, что самое минимальное нарастание гидролизованного крахмала с увеличением времени инкубации крахмала со слюнной амилазой отмечалось при рН 3. Полное отсутствие нарастания гидролизованного крахмала с увеличением времени инкубации крахмала со слюнной амилазой было выявлено при рН 2. Все эти полученные результаты указывают на то, что при снижении рН с 7 до 3 способствует не только уменьшению активности амилазы слюны, но также снижению интенсивности гидролиза крахмала.

Выводы: Наибольшая активность амилазы слюны в желудке проявляется в диапазоне рН от 7 до 5. Со снижением рН ниже 5, отмечается выраженное понижение амилолитической активности. С уменьшением же рН до 3 проявляется минимальная активность слюнной амилазы, а при рН 2 она полностью отсутствует. Кроме того, изменение рН в пределах от 7 до 3 влияет на снижение интенсивности гидролиза крахмала. Помимо этого при снижении рН меньше 5 уменьшается интенсивность гидролиза и образование гидролизованного крахмала, которое понижается до рН 3 и отсутствует при рН.

Список литературы:

1. Ballance S. et al. Evaluation of gastric processing and duodenal digestion of starch in six cereal meals on the associated glycaemic response using an adult fasted dynamic gastric model //European Journal of Nutrition. – 2013. – Т. 52. – №. 2. – P. 799-812.
2. Bergeim O., Intestinal chemistry: iii. Salivary digestion in the human stomach and intestines, Arch. Intern. Med., 1926, 37, 110–117.
3. Bornhorst G. M. and Singh R. P. Bolus formation and disintegration during digestion of food carbohydrates, Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 2012, 11, 101–118.
4. Dekkers, B. L., Kolodziejczyk, E., Acquistapace, S. et al.  Impact of gastric pH profiles on the proteolytic digestion of mixed βlg-Xanthan biopolymer gels //Food & function. – 2016. – Т. 7. – №. 1. – P. 58-68.
5. Freitas D., Le Feunteun S. Oro-gastro-intestinal digestion of starch in white bread, wheat-based and gluten-free pasta: unveiling the contribution of human salivary α-amylase //Food chemistry. – 2019. – Т. 274. – P. 566-573.
6. Fried M., Abramson S. and Meyer J. H. Passage of salivary amylase through the stomach in humans, Dig. Dis. Sci., 1987, 32, 1097–1103.
7. Gao, J., Tan, E. Y. N. et al.  From bolus to digesta: How structural disintegration affects starch hydrolysis during oral-gastro-intestinal digestion of bread //Journal of Food Engineering. – 2021. – Т. 289. – P. 110161.
8. Lentle R. G., Janssen P. W. M. Physical aspects of the digestion of carbohydrate particles //The physical processes of digestion. – Springer, New York, NY, 2011. – P. 31-46.
9. Li, C., Yu, W., Wu, P., & Chen, X. D. Current in vitro digestion systems for understanding food digestion in human upper gastrointestinal tract //Trends in Food Science & Technology. – 2020. – Т. 96. – P. 114-126.
10. Malagelada J.-R., Go V. L. W. and Summerskill W. H. J. Different gastric, pancreatic, and biliary responses to solid-liquid or homogenized meals, Dig. Dis. Sci., 1979, 24, 101–110.
11. Martens, B. M., Bruininx, E. M., Gerrits, W. J., & Schols, H. A.  The importance of amylase action in the porcine stomach to starch digestion kinetics //Animal Feed Science and Technology. – 2020. – Т. 267. – P. 114546.
12. Woolnough, J. W., Bird, A. R., Monro, J. A., & Brennan, C. S. The effect of a brief salivary α-amylase exposure during chewing on subsequent in vitro starch digestion curve profiles //International journal of molecular sciences. – 2010. – Т. 11. – №. 8. – P. 2780-2790.