ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНЫМИ ГЛИКОЗИДАМИ СТРОФАНТИДИНОВОГО РЯДА ФЕРМЕНТА Nа,K-AТФАЗЫ И ИХ ПОЛОЖИТЕЛЬНО–ИНОТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ

АННОТАЦИЯ

Проведён анализ влияния структурно различающихся сердечных гликозидов группы строфантидина на ферментативную активность Nа,K-AТРазы и их положительно–инотропного действия на папиллярную мышцу. Константы ингибирования рассчитывались методом математического моделирования динамических систем по методу Рунге-Кутта. Положительно–инотропный эффект изучался на папиллярных мышцах левого желудочка крыс. Обнаружена корреляция между структурой сердечных гликозидов, их ингибирующим эффектом и  изометрическим сокращением папиллярной мышцы.

ABSTRACT

Analysis of the influence of structurally differing heart glycosides of the group of stroopantidine on the enzymatic activity of Nа,K-AТРаse and their positive-inothropic effect on the papillary muscle is carried out. The inhibition constants were calculated by the method of mathematical modeling of dynamic systems according to the runge-kutta method. A positive-inotropic effect was studied on the papillary muscles of the left-handed roof of rats. A correlation was detected between the structure of heart glycosides, their inhibiting effect and isometric contraction of the papillary muscle.

Ключевые слова: ингибиторы ферментов, структура фермента, структура белка, ингибирование сердечного гликозида, кардиотонические стероиды, взаимосвязь структура-активность, положительный инотропный эффект.

Keywords: enzyme inhibitors, enzyme structure, protein structure, cardiac glycoside inhibition, cardiotonic steroids, structure-activity relationship, positive-inothropic effect.

Nа,K-AТФаза  представляет  ферментную систему, осуществляющая противоградиентный перенос ионов натрия и калия  через клеточную мембрану за счет энергии гидролиза АТФ. Фермент входит в состав наружных мембран  всех животных  клеток и обеспечивает поддержание ионного гомеостаза клетки. Na,K-АТФаза  состоит  из двух пептидных цепей: каталитической a-субъединицы, куда входят ионные центры, ингибиторный участок, центры связывания и гидролиза субстрата, и гликопротеина β-субъединицы [1, 2]. Оба полипептида образуют компактную глобулу, насквозь пронизывающую мембрану [3].

Специфическими ингибиторами Na,K-АТФазы являются сердечные гликозиды, связывающиеся в рецепторном участке фермента. Этот класс растительных соединений относится к кардиотоническим препаратам, с давних времен используемых для борьбы с сердечной недостаточностью. Различают сердечные гликозиды дигиталисного и строфантидинового ряда. Молекулы сердечных гликозидов состоят из генинов (агликонов) и гликонов. Агликоны имеют стероидную цикло - пенитанперигидрофенантреновую структуру, у которых в положении С 17 имеется ненасыщенное лактонное кольцо. В зависимости структуры лактонного кольца генины сердечных гликозидов подразделяют на карденолиды (с пятичленным ненасыщенным кольцом) и буфадиенолиды (с шестичленным дважды ненасыщенным кольцом).  Под гликонами подразумевают остатки циклических сахаров, связанные через кислородный мостик с агликонами в положении С-3 и от этой части зависит сродство сердечных гликозидов к белкам плазмы и миокарда, всасывание и выведение из организма [4]. Na,K-АТФаза является аллостерическим ферментом и не конкурирует с субстратом за место связывания.

Сердечные гликозиды оказывают прямое избирательное действие на миокард и оказывают положительный инотропный эффект, вызывающий усиление сердечных сокращений, отрицательный хронотропный эффект, приводящий к урежению частоты сердцебиений,  отрицательный дромотропный эффект, связанный с уменьшением проводимости. Положительное инотропное действие сердечных гликозидов  проявляется в условиях сердечной недостаточности, когда удельный объем ограничен вследствие снижения сократимости миокарда.

Целью исследования было изучение процесса торможения сердечными гликозидами строфантидинового ряда высокоочищенного  препарата  Na,K-АТФазы (90 % чистоты по белку), полученного из медулы почек свиньи с оценкой инотропного эффекта на папиллярных мышцах крыс и установления корреляции между структурой изученных сердечных гликозидов,  их ингибирующим эффектом и положительно- инотропным действием препаратов.

Материалы и методы.

В работе использовали сердечные гликозиды,  любезно предоставленные Институтом химии растительных веществ АН РУз, а также ATP, EDTA («Reanal», Венгрия), трис («Serva», ФРГ), остальные реактивы отечественного производства квалификации х.ч. или ос.ч.

Выделение препарата Na,K-ATP-азы из мозгового слоя почек свиньи осуществляли по методу Йоргенсена [5] в градиенте плотности сахарозы с удельной активностью 25 мкмоль Ф_i, на 1 мг белка в мин. АТФ-азную активность определяли по высвобождению неорганического фосфата в среду инкубации, содержащую 130 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 2 мМ MgCl, 1 мМ АТР, 1 мМ ЭДТА, 30 мМ трис, рН 7,5 в присутствии 0,1 мл сердечного гликозида (Na-K-АТФазная активность) и без него (общая АТФазная активность). Неорганический фосфат определяли по методу Дальсаля [6]. Содержание белка определяли по модифицированному методу Лоури [7].

К растениям, содержащим сердечные гликозиды, относятся разные виды наперстянки (Digitalis purpurea L., Digitalis Lanata Ehrh. и др.) - дигитоксин, дигоксин; Строфантин (Strophanthinum ) - сердечный гликозид, содержащийся в семенах некоторых многолетних тропических растений (лианах) кутровых (Аросупасеае), строфантин G (Strophanthus gratus) – уабаин, (Strophanthus Коmbe) – строфантин К.; ландыш (Соnvallaria majalis L, .)- конваллотоксин; разные виды желтушника (Еrysimum саnescens Roth., Еrуsimum cheiranthоides L.) - эризимин, эризимозид; джут длинноплодный (Соrсhоrus оlitоrius L.) - олиторизид, корхорозид.  

Сердечные гликозиды группы строфантидина были выделены из растений Средней Азии и частичного синтеза в Институте химии растительных веществ АН РУз. Исследуемые вещества растворяли в воде, а также этиловом спирте и вносили в образец в таком количестве, чтобы конечная концентрация спирта составляла не более 2-4 %.

Кинетические исследования проводились в предстационарном состоянии при [S]₀ >> [E]₀ , где [S]₀ и [E]₀ ‒ начальные концентрации субстрата и фермента при содержании белка в пробе 2 мкг/мл (1,3·10^-8 М), концентрациях субстрата 1·10^-4 - 1·10^-3М, концентрации ингибитора 1·10^-5 М. Эксперименты по ферментативной активности проводили для каждой концентрации АТР по накоплению фосфора неорганического как в присутствии ингибитора так и без него как было описано в работе [8].

Инотропный эффект сердечных гликозидов изучали на папиллярных мышцах левого желудочка крыс. Препарат сердечной мышцы помещали в термостатируемую перфузионную камеру из органического стекла с питательным раствором при температуре 30⁰С. Стимуляцию папиллярных мышц проводили электрическим током с частотой 1 Гц, продолжительность импульса 1 мс. Амплитуду изометрического сокращения папиллярных мышц измеряли при концентрациях сердечных гликозидов 5∙10^-7, 1∙10^-7 и 5∙10^-8 г/л, расчеты проводили в % к контролю.

Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью программы “Origin 8.6”. Данные оценивали, используя параметрический t-критерий Cтьюдента, выражали в виде M±m. Достоверными считали результаты при р<0,05.

Результаты и обсуждение

В таблице 1 приведены структурные формулы строфантидина и его производных, их константы ингибирования, положительно- инотропные активности соединений.

Расчет констант ингибирования проводился методом математического моделирования динамических систем.

Ферментативную реакцию в случае одностороннего превращения субстрата можно выразить уравнениями (1) и (2):

где E – фермент; S – субстрат; ES – фермент- субстратный комплекс; P - продукт реакции; I – ингибитор, EI - фермент- ингибиторный комплекс; k₊₁ и k_-1 –константы скорости реакций образования и расщепления фермент- субстратного комплекса; k₊₂ -константа скорости распада фермент-субстратного комплекса, k₊₃  и k_-3 - константы скорости ассоциации и диссоциации фермент-ингибиторного комплекса.

Таблица 1.

Ингибирование строфантидином и его производными активности Nа,K-AТФазы и их положительно–инотропное действие на папиллярных мышцах

Проведение ферментативной реакции методами предстационарной кинетики в условиях избытка субстрата, который много больше фермента S>> E приводит к линеарезации кривых, что значительно упрощает вычисление констант скоростей реакции [9, 10, 11]. Однако в предстационарном состоянии кинетику ферментативной реакции необходимо проводить в очень узком временном диапазоне меньше 1 секунды, где требуются высокоточные спектрометры. В некоторых работах для определения констант использовались методы математического моделирования динамических систем в сочетании с методами компьютерной итерации (т. е. многократно повторяющийся численный метод) [12]. В нашей работе эксперименты по ферментативной кинетике проводились при S>>E и для вычисления кинетических параметров применялся метод математического моделирования динамической системы Рунге-Кутта. Константы ингибирования определяли по формуле К_i = k_-3/k₃ методом наименьших квадратов, отклонения составляли 0,003.

Механизм положительного инотропного действия сердечных гликозидов связывают с их способностью повышать содержание ионов кальция в кардиомиоцитах. Ингибирование Na,K-АТФ-азы мембраны кардиомиоцитов под действием сердечных гликозидов приводит к увеличению внутриклеточного содержания ионов натрия, который за счет трансмембранного обмена на внеклеточные ионы кальция, стимулирует его поступление в клетку и способствует высвобождению дополнительных количеств кальция из саркоплазматического ретикулума. Кальций взаимодействуя с тропониновым комплексом, устраняет его тормозящее влияние на сократительные белки миокарда, что приводит к большему образованию актомиозиновых связей и сильному сокращению сердечной мышцы [4].

В таблице 1 константы ингибирования сердечных гликозидов представлены в микромолях на литр, положительно- инотропное действие выражалось в % к контролю амплитуды изометрического сокращения папиллярных мышц при концентрациях сердечных гликозидов 5∙10^-7 , 1∙10^-7 и 5∙10^-8 г/л. В исследованные сердечные гликозиды входили строфантидин (соед.1) и аналоги агликона (соед.2-6), моногликозиды строфантидина (соед.7-9), дигликозиды строфантидина (соед.10-12). Для агликонов характерно наличие цис-связи между кольцами A и B, C и D, а также транс-связи между кольцами B и C. Конфигурационные изменения на С-17 атоме углеродного скелета приводят к сильной потере ингибирующей способности.

В структуре строфантидина характерным является наличие в молекуле альдегидной группы в положении С-10, метильной группы в положении С-13, гидроксильной группы в радикалах при С-3, при С-5 и в положении С-14. Из таблицы 1 видно, что строфантидин обладает сильным ингибирующим действием на Na,K-АТРазу (К_i =1,22 мкМ) и в этом он близок к наиболее известному кардиостероиду уабаину (К_i =1,04 мкМ). Строфантидин и оказывает умеренное положительно- инотропное действие, соответствующее ≈20, 12 % при концентрациях 5∙10^-7, 1∙10^-7 г/л. Ацетилирование 3-ОН группы строфантидина привело к высокому уровню торможения фермента (К_i =1,10 мкМ) и к увеличению положительно- инотропного действия в ≈ 42 - 12% при концентрациях 5∙10^-7 -5∙10^-8 г/л. Под действием строфантидола, имеющего спиртовую группу при R₁ – радикале, ингибирование фермента уменьшилось в 1,2 раза и влияние на папиллярную мышцу свелось к минимуму, составив лишь ≈12 % при концентрации 5∙10^-7 г/л. Однако введение кислотной группы в R₁ - радикал агликона резко на 2 порядка снизило ингибирующую способность строфантидиновой кислоты (К_i =26,7 мкМ) и лишило ее положительно- инотропного действия. В ≈ 3 раза уступает своему агликону по эффекту торможения 17α –оксистрофантидин - 3-ацетат, имеющий дополнительную гидроксильную группу при С-15 и ацетатную при С-3 радикале, также не влияющий на папиллярную мышцу. Практически не тормозит ферментативную активность псевдострофантидол (К_i =48,2 мкМ) с нарушенной структурной целостностью стероидного ядра агликона и не оказывает положительно- инотропного действия.

Среди гликонов высокое ингибирующее действие проявляют моногликозиды строфантидина с сахарным компонентом, присоединенным через С-3-ОН группу молекулы агликона. Молекула корхорозида-А, с введенным С-3-бонвинозидом тормозит ферментативную активность с К_i =1,33 мкМ и оказывает сильное положительно- инотропное действие в ≈ 72 - 36% при концентрациях 5∙10^-7 -5∙10^-8 г/л. Эризимин с С-3-дигитоксозидом подавляет ферментативную активность (К_i =1,24 мкМ) сродни строфантидину, но превышает его по положительно-инотропному эффекту в ≈62 - 20% при концентрациях 5∙10^-7 -5∙10^-8 г/л. Введение в ацетат строфантидина углеводного остатка в С-5-ОН группу, что видно на молекуле строфантидин-5-рамнопиранозид-3-ацетата, приводит к уменьшению эффекта торможения фермента в ≈1.6 раза (К_i =1,98 мкМ) и снижению изометрического сокращения мышцы в ≈ 25 – 7,5% при вышеназванных концентрациях.

Дигликозиды строфантидина, имеющие два углеводных производных – биозидов, введенных в молекулу через С-3 –ОН радикал, отличаются сильным эффектом торможения ферментативной активности и высоким влиянием на сердечную мышцу. К-строфантин - ß (строфантидин-3-строфантобиозид) ингибирует Na,K-АТРазу с К_i =1,11 мкМ , и оказывает сильное положительно- инотропное действие, составляющему ≈ 66 -22% при концентрациях 5∙10^-7 -5∙10^-8 г/л. Не отстает от него и эризимозид (строфантидин-3-дигиланидобиозид) ингибирующий ферментативную активность с К_i =1,31 мкМ и проявляющий положительно- инотропный эффект, равный ≈70 -32% при тех же концентрациях. Но введение двух сахарных компонентов через С-5 и С-3 группы в молекулу строфантидин-3,5-бисрамнопиранозида сразу снизило процесс торможения примерно в 1,5 раза, сохранив при этом положительно- инотропное действие в ≈66 -12% при аналогичных концентрациях.

Анализ влияния большого числа структурно различающихся сердечных гликозидов строфантидинового ряда на ферментативную активность Na,K-АТРазы позволил выявить взаимосвязь между структурой изученных соеди-нений и их ингибирующим действием. Также установлена взаимосвязь между процессом торможения производными строфантидина ферментативной активности и их положительно- инотропным действием на сердечную мышцу.

Изучение генинов строфантидина показало, что для связывания с рецепторным участком Na,K-АТРазы весьма важным является структурная целостность стероидного ядра агликона и наличие при С-17 ненасыщенного лактонового кольца. Так замена в строфантидине альдегидной группы в положении С-10 на спиртовую и особенно кислотную группировки, введение дополнительной ОН-группы в С-17 положение (соед. 3-6) снижало, а сильные изменения в структуре псевдострофантидола лишало ее ингибирующей способности. Не оказывали эти соединения и положительно- инотропного действия. Для активации агликона предполагается наличие внутримолекулярного Н – мостика между ОН группой С-14 положения и кислородом при С-22, который обеспечивает подходящую конформацию лактонового кольца. Однако в молекуле 17α –оксистрофантидин - 3-ацетата и особенно псевдострофантидола не наблюдалось должной конформации лактонового кольца.  

У моногликозидов и дигликозидов строфантидина  наибольшим торможением ферментативной активности и высоким положительно- инотропным эффектом отличались соединения с введенными через С-3-ОН группу углеводными компонентами (соед. 6,7,11,12). Наличие одной и двух сахарных компонент в молекуле сердечного гликозида, связанных с R₃ – радикалом весьма важно для стабилизации фермент- ингибиторного комплекса как за счет водородных связей в сахарном остатке, так и благодаря полярным группировкам углеводной компоненты, увеличивающих степень растворимости кардиостероидов. Присоединение сахарного компонента через С-5-ОН группировку вызвало снижение процесса торможения ферментативной активности гликонов. Таким образом для активации сердечных гликозидов весьма важным является не только обеспечение при С-17 ненасыщенного лактонового кольца, но и наличие гидроксильных групп при С-3, С-5 и С-14 положениях.

Основным показанием положительно-инотропного действия сердечных гликозидов  является сердечная недостаточность, обусловленная перегрузками сердца (артериальная гипертензия, клапанные пороки сердца, атеросклеротический кардиосклероз). При сердечной недостаточности сердечные гликозиды увеличивают ударный и минутный объем, снижают венозное давление и объем циркулирующей крови, улучшают кровоснабжение миокарда. Увеличение силы сердечных сокращений под влиянием кардиостероидов при сердечной недостаточности не сопровождается повышением потребления кислорода миокардом, поскольку уменьшение объема сердца и развиваемого им напряжения переводят его на энергетически более выгодный уровень работы.

Гликозиды группы строфантидина являются полярными, мало растворимы в липидах, практически не проникают в соединительную ткань, быстро оказывают действие, быстро выводятся из организма, не обладают кумулятивными свойствами [13]. В проведенной нами работе прослеживается корреляция между ингибирующим действием сердечных гликозидов и их положительно- инотропного действием на сердечную мышцу. Эти данные согласуются с работой [14] по влиянию производных уабаина и дигоксина на сократимость миоцитов желудочков кошки, где была обнаружена большая положительно-инотропная вариабельность между соединениями как с сильным так и слабым действием препаратов в зависимости от структуры. причем некоторые давали полные инотропные эффекты до наступления автоматизма, в то время как другие оказывали минимальную инотропию даже при больших концентрациях, вызывающих токсичность. Несмотря на то, что в ряде работ выдвигаются альтернативные механизмы инотропии, индуцированные гликозидами как активация каналов высвобождения кальция через рецепторы рианодина, в режиме скольжения, через пути передачи сигналов они не выдерживают проверок и как было показано с использованием уабаина, дигоксина и ацетилстрофантидина [15] не находят практических подтверждений изменять переходные процессы Ca²⁺ в инотропных процессах. Хотя в рамках в рамках современной терапии сердечной недостаточности используется также введение β-блокаторов, это не смогло отодвинуть на второй план применение сердечных гликозидов, которые успешно применяются в клинической практике в лечении сердечной патологии [16]. Применение сердечных гликозидов при начальной или скрытой сердечной недостаточности является не только терапевтическим, но и профилактическим мероприятием, с помощью которого можно выправить имеющиеся функциональные нарушения и предотвратить развитие явной недостаточности сердца.

Таким образом проведенные нами исследования по взаимодействию сердечных гликозидов строфантидинового ряда с Nа,К-АТФазой, определение кинетических параметров фермента, вносят существенный вклад в понимание природы процессов регуляции фермента специфическими ингибиторами. Совместное изучение активности cердечных гликозидов на молекулярном уровне на транспортном ферменте и положительно инотропном действии на сердечной мышце оказывает неоценимый вклад для поиска перспективных кардиотонических препаратов в качестве высоко-эффективных лекарственных препаратов целенаправленного действия.

Список литературы:

1. Jorgensen P.L., Pedersen P.A. Structure-function relationships of Na, K , ATP, or Mg binding and energy transduction in Na,K-ATPase // Biochim. et biophys. Acta. 2001. Vol.1505.№1. Р.57-74.
2. Laursen M., Yatime L., Nissen P., Fedosova N. Crystal structure of the high-affinity Na⁺,K⁺-ATPase – ouabain complex with Mg2+ bound in the cation binding site //| PROC. NATL. ACAD. SCI. 2013. Vol.110. №27. Р. 10958–10963.
3. Clausen M.V., Hilbers F., Poulsen H. The Structure and Function of the Na,K-ATPase Isoforms in Health and Disease // Frontiers in Physiology. 2017. Vol.8, № 371. Р.1-16.
4. Cornelius F., Kanai R., Toyoshima C. A Structural View on the Functional Importance of the Sugar Moiety and Steroid Hydroxyls of Cardiotonic Steroids in Binding to Na,K-ATPase // J. Biological Chemistry. 2013. Vol.288. Р. 6602-6616.
5. Jorgensen P.L. Purification and characterization of (Na⁺,K⁺)-ATPase. III. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium dodecylsulphate // Biochim. et biophys. acta. 1974. V. 356. № 1. P. 36—52.
6. Panusz H.T., Graczyk G., Wilmanska D., Skarzynski J. Analysis of Orthophosphate-Pyrophosphate Mixtures Resulting from Weak Pyrophosphatase Activities // Anal. Biochem. 1970. V. 35. P. 494—504.
7. Hartree Е.F. Determination of protein. A modification of the Loury method has a lines Photometric response // Anal. Biochem. 1972. V. 48. № 2. P. 422—427.
8. Umarova F.T., Khushbactova Z.A., Batirov E.H. and Mekler V.M. Inhibition of (Na⁺,K⁺)-ATPase by Flavonoids and Their Inotropic Effect. Investigation of the Structure-Activity Relationship // Membr. Cell Biol. 1998. Vol.12. № 1. PP. 27-40.
9. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика // Москва. 1979. «Наука», 312 с.
10. Clarke R.J., Apell H.J., Kong B.Y. Allosteric Effect of ATP on Na⁺,K⁺-ATPase Conformational Kinetics // Biochemistry. 2007. Vol. 46, PP. 7034-7044.
11. Kane D.J., Fendler K., Grell E., Bamberg E., Taniguchi K., Froehlich J.P., Clarke, R.J. Stopped-flow kinetic investigations of conformational changes of pig kidney Na⁺,K⁺-ATPase // Biochemistry. 1997. Vol.36. PP.13406-13420.
12. Garcia A., Rasmussen H.H., Apell H.J., Clarke J. Kinetic Comparisons of Heart and Kidney Na⁺,K ⁺-ATPases // Biophysical Journal. 2012. Vol.103. Р. 677–688.
13. Харкевич Д.А. Фармакология. М.:Изд. группа «ГЭОТАР-Медиа», 2012.750 c.
14. Ruch S.T., Nishio M., Wasserstrom A.J. Effect of Cardiac Glycosides on Action Potential Characteristics and Contractility in Cat Ventricular Myocytes: Role of Calcium Overload // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2003. Vol. 307. № 1. PP. 419-428.
15. Altamirano J., Li X., DeSantiago J., Piacentino V., Houser S.R., Donald M.B. The inotropic effect of cardioactive glycosides in ventricular myocytes requires Na+–Ca2+ exchanger function // J Physiol. 2006. Vol. 575. № 3. PP. 845–854. 
16. Konstantinou D.M., Karvounis H., Giannakoulas G. Digoxin in Heart Failure with a Reduced Ejection Fraction: A Risk Factor or a Risk Marker? // Cardiology. 2016. Vol. 134. №3. PP. 11–319.