АНТИФУНГАЛЬНАЯ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ ПШЕНИЦЫ (Triticum aestivum L.)

АННОТАЦИЯ

В данной работе проанализирована антифунгальная и антибактериальная активность ризобактерий пшеницы (Triticum aestivum L.): Pseudomonas aeruginosa С10, P. aeruginosa С23, P. stutzeri C4, Bacillus pumilus С16, B. cereus С19 и B. subtilis С27. Результаты экспериментов свидетельствуют о более эффективном подавлении фитопатогенных грибов рода Fusarium ризобактериями P. aeruginosa С10, P. stutzeri   С4 и B. pumilus С16.   Показано, что ризобактерии рода Bacillus демонстирируют наиболее высокую антагонистическую активность к патогену Alternaria alternata. Установлено, что штамм P. aeruginosa С10 обладает наиболее высокой бактериоцидной активностью к бактериям-патогенам: Bacillus badius, Bacillus mesentericus, Bacillus  mojavensis.

ABSTRACT

In this work, we analyzed the antifungal and antibacterial activity of wheat (Triticum aestivum L.) rhizobacteria: Pseudomonas aeruginosa C10, P. aeruginosa C23, P. stutzeri C4, Bacillus pumilus C16, B. cereus C19, and B. subtilis C27. The experimental results indicate a more effective suppression of phytopathogenic fungi of the genus Fusarium by rhizobacteria P. aeruginosa C10, P. stutzeri C4 and B. pumilus C16. It was shown that rhizobacteria of the genus Bacillus demonstrate the highest antagonistic activity against the pathogen Alternaria alternata. It was established that the P. aeruginosa C10 strain has the highest bactericidal activity against pathogenic bacteria: Bacillus badius, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis.

Ключевые слова: ризобактерии, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, активность, антагонизм, фитопатогены, тест-культуры

Keywords: rhizobacteria, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, activity, antagonism, phytopathogens, test cultures

Введение

Известно, что одним из главных проблем сельскохозяйственной практики является заболевания растений, обусловленные фитопатогенными грибами и бактерий. Прогнозируется, что в настоящее время пшеница станет самой важной зерновой культурой в мире, чтобы прокормить постоянно растущее население Земли [1]. Из-за различных болезней ежегодно теряются миллионы тонн сельскохозяйственной продукции [2]. Успешное применение химических препаратов, приводит к ряду экологических проблем, связанных с постоянным их использованием для борьбы с вредителями растений [3-5]. В этом контексте, ризобактерии, стимулирующие рост растений (PGPR - Plant growth-promoting rhizobacteria), усиливают адаптивный потенциал своих хозяев с помощью различных механизмов, включая мобилизацию трудно восприимчивых питательных веществ почвы, фиксацию молекулярного азота и синтез фитогормонов. PGPR также обладают несколькими свойствами, которые позволяют им действовать как агенты биоконтроля: они продуцируют сидерофоры, антибиотики и различные ферменты, которые можно использовать для ограничения повреждений растений, вызываемых грибковыми патогенами [6-10].

Следовательно, необходимо разработать альтернативные механизмы индуцирования резистентности растений к патогенам, таким как грибы, бактерии, насекомые, простейшие и вирусы. Так, биологический контроль с использованием антагонистических микроорганизмов предлагает недорогую экологически чистую технологию, которая снижает количество и активность фитопатогенов растений.

Исходя из вышесказанного, целью исследования является изучение антифунгальной и антибактериальной активности местных штаммов ризосферных бактерий пшеницы (Triticum aestivum L.) рода Bacillus и Pseudomonas.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. В работе использовали штаммы бактерий рода Bacillus и Pseudomonas выделенные из ризосферы пшеницы «Дустлик» и «Гром» возделываемый в Сырдарьинском регионе Республики [11].

Питательные среды и условия культивирования. В работе для хранения, размножения и поддержания культур ризосферных штаммов Pseudomonas aeruginosa С10, P. aeruginosa С23, P. stutzeri C4, Bacillus pumilus С16, B. cereus С19 и B. subtilis С27 использовались следующие питательные среды:

1. Мясо-пептонный агар (МПА).
2. Мясо-пептонный бульон (МПБ).
3. Картофельно-глюкозный агар (КГА) (состав г/л): картофельный отвар (0,2 кг картофеля в литре воды), глюкоза – 20, агар-агар – 15.

Изучение фунгицидной активности. Тест-культурами при изучении фунгицидных свойств ризобактерий послужили штаммы фитопатогенных грибов: Verticillium dahlia 57, F.oxysporum f. sp. vasinfectum 181, Alternaria alternata (штаммы из коллекции Института микробиологии АН РУз). Культуры бактерий-антагонистов выращивали на жидкой среде МПБ стационарно при 28°С в течение 3-х суток, фунгицидную активность определяли с помощью метода «колодцев» [12] на картофельно-глюкозном агаре. Для этого поверхностным смывом с колонии гриба готовили суспензию спор с титром 10⁵ КОЕ/мл. 20 мкл полученной суспензии вносили в расплавленный и охлажденный до 45°С картофельно-глюкозный агар объемом 200 мл. Питательную среду разливали по чашкам, после застывания среды стерильным пробочным сверлом в ней делали отверстия. В полученные «колодцы» вносили по 100 мкл культуры бактерий-антагонистов. Посевы инкубировали 5 суток при 25°С, после инкубации фунгицидную активность оценивали по диаметру зон ингибирования фитопатогена вокруг «колодца».

Изучение бактерицидной активности.  Бактерицидную активность проверяли на 3-х штаммах фитопатогенных бактерий: Bacillus badius, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis выделенных из заражённых листьев томата, выращенного в условиях закрытого грунта в Ташкентской области, и идентифицированного методом масс-спектрометрии MALDI-TOF. Бактерицидную активность изучали с помощью метода «колодцев» [12] на 2% картофельном агаре (20 г очищенного картофеля отваривали 30 мин, фильтровали через марлю, к фильтрату добавляли 15 г агара, объем доводили до 1 л, устанавливали pH=7,0, разливали по колбам, стерилизовали 20 мин при 1 атм.). Питательную среду разливали по чашкам, после застывания среды стерильным пробочным сверлом в ней делали отверстия диаметром 8 мм. Тест-культуры фитопатогенных бактерий засевали газоном на поверхность картофельного агара, затем в полученные «колодцы» вносили по 100 мкл культуры бактерий-антагонистов с титром клеток 10⁸ КОЕ/мл. Посевы инкубировали 48 ч при температуре 28°С, бактерицидную активность оценивали по диаметру зон ингибирования фитопатогена вокруг «колодцев».

Антимикробные вещества, диффундирующие в толщу агара, задерживали рост чувствительных к ним микроорганизмов, что проявлялось в образовании зон отсутствия роста микробов-патогенов.

Результаты и их обсуждение

Ранее нами были изолированы и идентифицированы ростостимулирующие и фосфатсолюбилизирующие ризобактерии рода Bacillus и Pseudomonas [11]. В данной работе исследовали антагонистические свойства эффективных ростостимулирующих и фосформобилизующих ризобактерий к фитопатогенным грибам Fusarium sp. 17, F. oxysporum, F. oxysporum f. sp. vasinfectum 181, Alternaria alternata и бактериям Bacillus badius, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis. Результаты экспериментов свидетельствуют о более эффективном подавлении фитопатогенных грибов рода Fusarium ризобактериями P. aeruginosa С10, P. aeruginosa С23, P. putida 12, P. stutzeri  С4, Bacillus pumilus С16, Bacillus cereus С19 и Bacillus subtilis С27. Антагонистический эффект ризобактериальных штаммов измеряли по диаметру зоны ингибирования гриба-патогена. Следовательно, зоны подавления роста фитопатогенных грибов Fusarium sp.17, F. oxysporum и F. oxysporum f. sp. vasinfectum 181 ризобактериями P. aeruginosa С10 составляет 21,6 мм, 26 мм и 22 мм, соответственно (табл.1). Известно, что бактерии рода Pseudomonas являются одним из наиболее распространенных полезных ризобактерий среди больших и гетерогенных бактериальных популяций в ризосфере и поэтому привлекают все большее внимание как источник потенциальных биологических агентов контроля [13-16].

Показано, что зоны подавления роста и развития фитопатогенных грибов Fusarium sp.17, F. oxysporum и F. oxysporum f. sp. vasinfectum 181 ризобактериями B. pumilus С16, B. cereus С19 и B. subtilis С27 составляет 16 мм, 18 мм и 15 мм; 14мм, 12 мм и 14 мм; 12 мм, 10 мм и 14 мм, соответственно (табл.1 и рис. 1). 

Таблица 1.

Биофунгицидное действие различных штаммов ризобактерий

Следует отметить, что P. aeruginosa С10 активно подавляет рост и развитие фитопатогенных грибов рода Fusarim, но не активен к Alternaria alternata. В то же время ризобактерии рода Bacillus демонстировали наиболее высокую антагонистическую активность к патогену Alternaria alternata. Так, зоны подавления роста и развития Alternaria alternata культурами B. pumilus С16, В. cereus С19 и B. subtilis С27 составляет 20 мм, а 24 мм и 25 мм, соответственно (рис.1).

а)                                                        б)                                                         в)

Рисунок 1. Антагонистическая активность штаммов ризобактерий рода Pseudomonas и Bacillus по отношению к фитопатогенным грибам:

а) Fusarium sp.17; б) F.oxysporum f. sp. vasinfectum 181; в) Alternaria alternata

Это согласуется с тем, что бактерии рода Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Herbaspirillum, Ochrobactrum, Pseudomonas, Serratia являются хорошо известными бактериями-антагонистами. Они обладают широким спектром антагонистической активности для борьбы с фитопатогенами [17-20].

Также была проанализирована бактерицидная активность ризосферных штаммов рода Bacillus и Pseudomonas по отношению к различным штаммам фитопатогенных бактерий (Bacillus badius, Bacillus mesentericus, Bacillus mojavensis).

В таблице 2 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям.

Таблица 2.

Антибактериальное действие различных штаммов ризобактерий

Экспериментально установлено, что штамм P. aeruginosa С10 обладает наиболее высокой бактериоцидной активностью против исследованных фитопатогенных бактерий (табл.2, рис.2). Так, зона ингибирования в отношении Bacillus badius составляла 26 мм, Bacillus mesentericus – 18 мм, на Bacillus mojavensis – 22 мм (табл.2). Полученные результаты согласуется с тем, что многие виды P. aeruginosa обладают особенностями, которые могут быть ценными с точки зрения использования их в сельском хозяйстве, главным образом благодаря своей устойчивости, способности конкурировать с патогенами и способности продуцировать вторичные метаболиты, подавляющие рост патогенов. Соответственно, такие штаммы являются потенциальными агентами биоконтроля [21-24].

а)                                                    б)                                                    в)

Рисунок 2. Антагонистическая активность штаммов ризобактерий рода Pseudomonas и Bacillus по отношению к фитопатогенным бактериям:

а) Bacillus badius; б) Bacillus mesentericus; в) Bacillus mojavensis

Проведенными исследованиями установлено, что ризобактерии P. putida С12, P. stutzeri  С4, B.cereus С19, B. subtilis С27 подавляют рост и развитие патогенов Bacillus badius, Bacillus mesentericus и Bacillus mojavensis. Тогда как культура B. pumilus С16 оказался самым неустойчивым к действию исследуемых патогенов (табл.2). Следует отметить, что культура B. cereus С19 проявляет выраженную антагонистическую активность в отношении трех исследуемых тест-культур.

Таким образом, проанализирована фунгицидная и бактерицидная активность ростостимулирующих ризобактерий P. aeruginosa С10, P. aeruginosa С23, P. stutzeri  С4, P. putida С12, B. pumilus С16, B. cereus С19 и B. subtilis С27. Экспериментально установлено, что исследуемые штаммы ризобактерий обладают фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов Fusarium sp.17, F. oxysporum и F. oxysporum f. sp. vasinfectum 181. Показано что P. aeruginosa С10 активно подавляет рост и развитие фитопатогенных грибов рода Fusarim. Штамм ризобактерий B.cereus С19 проявляет выраженную антагонистическую активность в отношении фитопатогенных бактерий: Bacillus badius, Bacillus mesentericus и Bacillus mojavensis. Ризобактерии - антагонисты могут быть полезны при разработке новых инокулянтов с комбинациями различных механизмов действия, что приведет к более эффективному использованию стратегий биоконтроля для улучшения продуктивности сельскохозяйственных растений.

Список литературы:

1. Hoisington D., Khairallah M., Reeves T. (1999): Plant genetic resources: What can they contribute towards increased crop productivity? Proc.Nat. Acad. Sci. USA., 96: 5937-5943.
2. Bajoria S., Varshney A.K., Pareek R.P., Mohan M.K., Ghosh P. (2008): Screening and characterization of antifungal clusterbean (Cyamopsis tetragonoloba) rhizobacteria. Biocontrol Sci.Technol., 18: 139-156.
3. Glick B.R. (2014): Bacteria with ACC deaminase can promote plant growth and help to feed the world. Microbiol.Res., 169: 30-39.
4. Sindhu S.S., Dadarwal K.R. (2001): Chitinolytic and cellulolytic Pseudomonas sp. antagonistic to fungal pathogens enhances nodulation by Mesorhizobium sp. Cicer in chickpea. Microbiol. Res., 156:353-358.
5. Yang Q.Y., Jia K., Geng W.Y., Guo R.J. and Li S.D. (2014): Management of cucumber wilt disease by Bacillus subtilis B006 through suppression of Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum in rhizosphere. Plant Pathol. J., 13: 160-166.
6. Domenech J., Reddy M.S., Kloepper J.W., Ramos B., Gutierrez Man˜ero J., 2006. Combined application of the biological product LS213 with Bacillus, Pseudomonas or Chryseobacterium for growth promotion and biological control of soilborne diseases in pepper and tomato. Biocontrol 51, 245–258.
7. Saraf M., Pandya U. and Thakkar A. (2014): Role of allelochemicals in plant growth promoting rhizobacteria for biocontrol of phytopathogens. Microbiol. Res., 169: 18-29.
8. Zandi P., Basu S.K. Role of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers in stabilizing agricultural ecosystems. In Organic Farming for Sustainable Agriculture; Nandwani, D., Ed.; Springer: Cham, Switzerland, 2016; pp. 71–87.
9. Raklami A., Bechtaoui N., Tahiri A., Anli M., Meddich A., Oufdou K. Use of rhizobacteria and mycorrhizae consortium in the open field as a strategy for improving crop nutrition, productivity and soil fertility. Front. Microbiol. 2019, 10, 1106.
10. Atieno M., Herrmann L., Nguyen H.T., Phan H.T., Nguyen N.K., Srean P., Than M.M., Zhiyong R., Tittabutr P., Shut srirung, A., et al. Assessment of biofertilizer use for sustainable agriculture in the Great Mekong Region. J. Environ. Manag. 2020, 275, 111-300.
11. Kadirova G.Kh, Zakiryaeva S.I., Abdullaev A.K., Usmankulova A.A., Payzilloev A.K.Growth stimulating and phosphorus-mobilizing activity of wheat rhizobacteria (Triticum aestivum L.) of the genus Pseudomonas and Bacillus / Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases. 2021, 13, vol. 39, Р.669-679.
12. Magnusson J., Schnurer, J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad – spectrum proteinaceous antifungal compound. Applied and Environmental Microbiology. 2001.Vol.67. – No.1. – P.1–5.
13. Yasmin S., Hafeez F.Y., Rasul G. Evaluation of Pseudomonas aeruginosa Z5 for biocontrol of cotton seedling disease caused by Fusarium oxysporum. Biocontrol Sci. Technol. 2014, 24, 1227–1242.
14. Gupta G., Das Gupta A., Jha P.N. Biocontrolling and Colonization Potential of Pseudomonas aeruginosa PM389 Isolated from Pennisetum glaucum under Field Conditions. Int. J. Res. Emerg. Sci. Technol. 2015, 2, 104–116.
15. Yasmin, S.; Hafeez, F.Y.; Mirza, M.S.; Rasul, M.; Arshad, H.M.I.; Zubair, M.; Iqbal, M. Biocontrol of Bacterial Leaf Blight of rice and profiling of secondary metabolites produced by rhizospheric Pseudomonas aeruginosa BRp3. Front. Microbiol. 2017, 8, 1895.
16. Chandra H., Kumari P., Bisht R., Prasad R., Yadav S. Plant growth promoting Pseudomonas aeruginosa from Valeriana wallichii displays antagonistic potential against three phytopathogenic fungi. Mol. Biol. Rep. 2020, 47, 6015–6026.
17. Berg G. Plant-microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture. Appl microbiol biotechnol. 2009; 84: 11-18.
18. Tariq M, Yasmin S, Hafeez FY. Biological Control of Potato Black Scurf by Rhizosphere Associated Bacteria. Braz J Microbiol. 2010; 41: 439-451.
19. Beneduzi A., Ambrosini A., Passaglia L.M.P. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Their potential as antagonists and biocontrol agents. Genet. Mol. Biol. 2012, 35, 1044–1051.
20. Balthazar C., Novinscak A., Cantin G., Joly D.L., Filion M. Biocontrol activity of Bacillus spp. and Pseudomonas spp. Against Botrytis cinerea and other cannabis fungal pathogens. Phytopathology 2021, 1–47.
21. Spago F.R., Ishii Mauro C.S., Oliveira A.G., Beranger J.P.O., Cely M.V.T., Stanganelli M.M., Simionato A.S., San Martin J.A.B., Andrade C.G.T.J., Mello J.C.P., et al. Pseudomonas aeruginosa produces secondary metabolites that have biological activity against plant pathogenic Xanthomonas species. Crop Prot. 2014, 62, 46–54.
22. Keshavarz-Tohid V., Taheri P., Muller, D., Prigent-Combaret C., Vacheron J., Taghavi S.M., Tarighi S., Moënne-Loccoz Y. Phylogenetic diversity and antagonistic traits of root and rhizosphere pseudomonads of bean from Iran for controlling Rhizoctonia solani. Res. Microbiol. 2017, 168, 760–772.
23. Uzair B., Kausar R., Bano S.A., Fatima S., Badshah M., Habiba U., Fasim F. Isolation and Molecular Characterization of a Model Antagonistic Pseudomonas aeruginosa Divulging In Vitro Plant Growth Promoting Characteristics. Biomed Res. Int. 2018, 2018, 6147380.
24. Wang X., Zhou X., Cai Z., Guo L., Chen X., Chen X., Liu J., Feng M., Qiu Y., Zhang Y., et al. A biocontrol strain of Pseudomonas aeruginosa CQ-40 promote growth and control Botrytis cinerea in tomato. Pathogens 2021, 10, 22.