РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА ПРИ ГИПЕРТЕРМИИ

АННОТАЦИЯ

В настоящей работе на примере пероксида водорода (H2O2) изучено влияние теплового стресса на активные формы кислорода (АФК) и антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза (СОД; EC 1.15.1.1), каталаза (КАТ; EC 1.11.1.6) и пероксидаза (ПО; EC 1.11.1.7) в сортах хлопчатника Сурхан-103 из семейства Gossypium barbadanse полученный методом классической селекции и методом «ген нокаут» (Порлок-4) также маркер ассоциированной селекции (МАС) (Равнак-1). Для оценки влияния теплового стресса на биохимические показатели различных сортов хлопчатника исследуемые растения подвергали воздействию температур (35, 45 и 50⁰С) в течении 1 часа. Результаты показали, что с повышением температуры содержание пероксида водорода увеличивалось во всех исследуемых сортах хлопчатника, при этом исследуемые сорта Сурхан-103 и биотехнологические сорта из семейства Gossypium hirsutum – Порлок-4 и Равнак-1 по-разному реагировали на воздействие теплового стресса для снижения повышенного уровня пероксида водорода.

ABSTRACT

The effects of thermal stress on reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes, to name superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.11), catalase (CAT; EC 1.11.1.6) and peroxidase (PO; EC 1.11.1.7) produced by hydrogen oxide (H2O2) in the Surkhan-103 cotton species, Gossypium barbadanse, were studied. The responses of cotton species generated by gene knockout (Porlok-4) and by the associated selection marker (Ravnak-1) were comparatively analyzed. To assess the thermal stress effects on the biochemical parameters in various cotton species, the plants under study were subjected to the effect of high temperatures (35, 45 and 50°C) for 1 hour. The findings demonstrated increase in the hydrogen oxide concentrations in all species under study; the reduction in SOD activity was observed in Surkhan-103, as compared to other controls. Biotechnologically generated species of Gossypium hirsutum family, such as Porlok-4 and Ravnak-1, were found to response differently to the effect of thermal stress to reduce higher hydrogen oxide concentrations.

Ключевые слова: хлопчатник, температурный стресс, активные формы кислорода, пероксид водорода, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза.

Key words: cotton, thermal stress, reactive oxygen species, hydrogen peroxide, superoxide dismutase, catalase, peroxidase

ВВЕДЕНИЕ

Влияние на растения высоких температур является одним из наиболее распрастраненных абиотических стрессоров, определяющий их продуктивность, особо актуальны проблемы термоустойчивости сельхоз культур, ибо, высокие температуры значительно снижают вегетативный рост и урожайность различных растений. Исходя из этого выяснение биохимических механизмов обеспечивающих выживание растений в экспериментальных условиях при действии повышенной температуры к отдельному генотипу имеет большое теоритическое и практическое значение. Известно, что, хлопчатник (Gossypium hirsutum L.) весьма чувствителен к воздействию высоких температур в период вегетации. Высокая температура оказывает неблагоприятное воздействие на растения путем нарушения клеточного гомеостаза и метаболизма, разобщения основных физиологических и биохимических процессов [6], приводящей к изменению скорости фотосинтеза и усиление фотодыхания [16]. Генерация АФК является неизбежным следствием температурного воздействия на растения и вызывает окислительный стресс в растительной клетке. Образование АФК в клетке происходит постояанно, основными АФК являются супероксидный анион-радикал, перекись водорода и синглетный кислород, которые играют важную роль в жизнедеятельности растений. При действии засухи, высокой температуры может происходить неконтролируемое накопление АФК, повышение перекисного окисления липидов, что приводит к гибели клеток растений. Перекись водорода является одной из активных форм кислорода, будучи самой стабильной из них она играет большую роль в качестве сигнальной молекулы в клеточном метаболизме. Однако в стрессовых условиях чрезмерная генерация АФК нарушает равновесие и вызывает повреждение, что приводит к запрограммированной гибели клеток, а также снижение продуктивности растений [3]. В нейтрализации АФК принимают участие высокомолекулярные ферменты-антиоксиданты, среди которых важнейшую роль играют супероксиддисмутаза (СОД; EC 1.15.1.1) которое катализирует реакцию восстановления супероксид радикала до пероксида водорода. Каталаза (КАТ; EC 1.11.1.6) катализирует разложение перекиси водорода с выделением молекулярного кислорода. Каталаза в отличие от пероксидаз эффективно ингибирует высокие концентрации перекиси водорода при стрессах. Пероксидаза (ПО; EC 1.11.1.7) восстанавливает пероксид водорода до воды при участии различных субстратов. Пероксидазная активность может варьировать в растениях в зависимости от вида стрессового фактора и растений.

В связи с вышесказанным биохимические исследования, ответных реакций хлопчатника на высокие температуры на основе определения взаимодействия активных форм кислорода (АФК) с ферментами антиоксидантной системы позволяет лучше понять механизм ферментативных реакций, благодаря которым приобретают повышенную устойчивость к гипертермии. Исходя из этого целью данной работы было изучение активности антиоксидантных ферментов, а также индикаторов окислительного стресса- пероксида водорода трех сортов хлопчатника в условиях теплового стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал и термообработка. Семена биотехнологических сортов, полученных методом ген нокаута (Порлок-4) и маркер ассоциированной селекции (МАС) Равнак-2 были предоставлены Центром геномики и биоинформатики АН РУз. Сорт Порлрок-4 обладает уникальными свойствами – высокой урожайностью, скороспелостью, высоким качеством волокна. На сегодняшний день «Порлок» является единственным сортом сельскохозяйственных растений, созданным в Узбекистане с применением технологий генной инженерии. Из традиционно выращиваемых в Узбекистане сортов хлопчатника, дающих волокно преимущественно четвертого-пятого типа, ученными был получен сорт Порлок-1 который позволяет получать волокно 1-2 типа. Сорт  «Равнак-2», характеризующийся качественным волокном 3-го типа и высокой урожайностью, представляет собой современный селекционный образец, основанный на участках генома, который четко реагирует на полезные агрономические признаки с использованием технологии MAС в селекции хлопка. В качестве сорта полученный методом классической селекции использовали Сурхан-103 из семейства Gossypium barbadanse предоставленный НИИ селекции, семеноводства и агротехнологии выращивания хлопка МВСХ Руз. Семена хлопчатника оголяли в концентрированной серной кислоте, затем промывали под струей холодной воды в течении 10-15 минут. Оголенные семена выдерживали в дистиллированной воде течении 12 часов. Набухшие семена, завернутые в бумажные рулоны, проращивали в течение 7 суток во влажной камере при 27^оС. После седьмого дня проростания, половина проростков оставляли в камере в качестве контрольного набора, вторую половину подвергали воздействию температур 35, 45 и 50⁰С течении одного часа для создания условий теплового стресса [7]

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы анализа данных Atte Stat V.10.9.6, работающей как надстройка программы “Microsoft Excel-2007”.

Расчёты также выполнены с использованием пакета компьютерных программ математической статистики SPSS. В частности, использованы программы однофакторного дисперсионного анализа по непараметрическому методу Краскела-Уоллиса, которая является аналогом параметрического метода One-Way ANOWA и рангового корреляционного анализа по методу Тау-Кендалла.

Определение активности антиоксидантных ферментов. Для получения экстракта навеску ткани массой 500 мг растирали в холодной фарфоровой ступке с добавлением жидкого азота, затем добавляли 0,5 мл ацетатного буфера (pH-5,0, полученный гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g. Для определения активности ПО в качестве субстрата использовали о-дианизидин (3,3-Диметоксибензидин) путем определения увеличения оптической плотности при 460 нм. Аналитическая смесь содержала 0,05 мл о-дианизидина (20 мМ), 2,88 мл K-фосфатного буфера (10 мМ, pH 7,0) и 50 мкл экстракта фермента. Реакция была инициирована с добавлением 20 мкл H₂O₂ (40 мМ) [24].

Активность СОД определяли по ингибированию фотовосстановления нитросинего тетразолия (НСТ) [4]. Инкубационная среда для определения активности СОД содержала 50 мМ K, Na-фосфатный буфер (pH-7,8), 172 мкМ НСТ, 210 мкМ метионин, 24 мкМ рибофлавин, 0.1% тритон Х-100. Для определения активности СОД измеряли уменьшение оптической плотности при 560 нм после 30 минут инкубации. Активность СОД выражали в усл. ед. на 1 мг белка за 30 минут (усл. ед./мг белка). Содержание белка в экстракте определяли по методу Лоури [12] с использованием в качестве контрольного стандарта бычий сывороточный альбумин.

Активность каталазы определяли с помощью некоторых модификаций по методу Sinha. Этот метод [14] основан на восстановление дихромата до ацетата хрома в присутствии уксусной кислоты при молярном соотношении 1:3. В этом методе дихромат при нагревании в уксусной кислоте в присутствии перекиси водорода (H₂O₂) восстанавливается до ацетата хрома, с последующим образованием перхромовой кислоты, являющимся нестабильным промежуточным продуктом. Концентрация перекиси водорода прямо пропорционально концентрациям ацетата хрома, который измеряется спектрофотометрически при длине волны 570 нм.

Содержание пероксида водорода определяли по методу [20] где из свежих образцов ткани листьев (100 мг) экстрагировали пероксид водорода путем добавления 4 мл 0,1% раствора трихлоруксусной кислоты (TХУК) и центрифугировали течение 15 мин при 12000 об. Затем брали 0,5 мл супернатанта и смешивали с 0,5 мл 10 мМ фосфатным буфером (pH = 5,5) и 1 мл 1 М раствором йодистого калия. Поглощение определяли методом спектрофотометрии при длине волны 390 нм. Количество H₂O₂, вычисляли с помощью коэффициента экстинкции 0,28 мкм 1 см -1 и выраженный как нмоль г -1 FW

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что изменения уровня H₂O₂ в растительных клетках при стрессах является индикатором окислительного стресса [25]. Генерация активных форм кислорода является фундаментальным процессом у высших растений и используется для передачи сигнала в ответ на изменение условий окружающей среды [17]. Полученные нами результаты показывают (рис.1), что термообработка проростков хлопчатника вызвало прогрессивное увеличение уровня Н₂О₂ по сравнению с контрольными образцами.

Таблица 1.

Содержание пероксида водорода в листях 7 суточных проростков хлопчатника при воздействии различных температур (n=3;M ±m)

Первичный уровень пероксида водорода в сорте Сурхан-103 составила 73 нмоль/г и повышалось до 97,4 нмоль/г при термической обработке. В сорте Порлок-4 разница между контролем и образцами подвергнутых температуре 35°C составляла 75%, тогда как этот эффект вызвал повышение пероксида водорода на 7% в сорте Сурхан-103 и 8,75% у Равнак-1. Максимальный уровень накопление пероксида водорода при высокой температуре (50⁰С) отмечено также в сорте Порок-4. При этом содержание H₂O₂ повышалось на 170% по отношению к контрольным образцам. Аналогичные результаты получены в исследованиях [19] в которых выявлено, что термообработка повышала уровень пероксида водорода в различных генотипах хлопчатника в полевых условиях при воздействии 48⁰С. Кроме того результаты исследования [1] доказали, что уровень Н₂О₂ увеличивался на 18 % при 38 и 45 ⁰С в ответ на тепловой стресс в сортах хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) Очевидно, окислительная реакция запускает механизмы защиты растений, активируя высокомолекулярные антиоксиданты среды которых важную роль играют супероксиддисмутаза, каталаза, группа пероксидаз [18].

Относительно высокий уровень H₂O₂ коррелирует с более высокой активностью СОД (EC 1.15.1.1), этот фермент обычно рассматривается как первая линия защиты против окислительного стресса [5] .Образующиеся в хлоропластах токсичные супероксидные анионные радикалы легко превращаются с помощью СОД в пероксид водорода и молекулярный кислород, затем КАТ (EC 1.11.1.6) и неспецифичная ПО (EC 1.11.1.7 снижают повышенный уровень пероксида водорода до нетоксичного уровня за счет катоболизма до воды и молекулярный кислород. В литературе имеются данные, что толерантность сельскохозяйственных культур к высокой температуре связана с увеличением активности антиоксидантных ферментов [2]

Полученные нами результаты выявили снижение активности СОД во всех исследуемых сортах при 45°C однако, значительное снижение наблюдалось только в сорте Порлок-4 по отношению с контрольными образцами (табл.2).

Таблица 2.

Активность супероксиддисмутазы в листях 7 суточных проростков хлопчатника при воздействии различных температур (n=3;M ±m)

Активность СОД при 45°C снизилось на 48% у Порлок-4 по сравнению с образцами подвергнутых к воздействию 35°C . Аналогичные результаты полученных в исследованиях [1] отмечено снижение активности СОД при термообработке (38 и 45 °C) проростков хлопчатника (Gossypium hirsutum L.), которое объясняется либо повышенным уровнем деградации ферментов, либо снижением синтеза этого фермента. В исследованиях [9] также отмечалось снижение активности СОД при температуре 35⁰С в двух сортах по сравнению с контрольными образцами.

В биотехнологических сортах при 50°C отмечено повышение активности СОД по сравнении с 45 °C на 38% и 34% в Порлок-4 и Раввнак-2, тогда как сорт Сурхан-103, полученный методом традиционной селекции подобных результатов не проявлял. Эффекты повышения активности СОД при умеренном действии высоких температур зарегистрированы на многих культурах: высокая температура в листьях растений вишни вызвал увеличение активности супероксиддисмутазы на 19% при 50°C после 2 часа термообработки и через 24 часа также активность возросла на 43% по сравнению с контролем [27]. Авторы связывают повышение активности СОД как с инициализацией фитогормонами экспресси генов супероксиддисмутазы так и с увеличением образования активных форм кислорода (АФК). Также у проростков кукурузы при тепловом стрессе и засухе отмечалось повышение активности СОД в листях и корнях [8].

В системе антиоксидантной защиты от стрессов большую роль играет каталаза (КAT; EC 1.11.1.6) которая представляет собой тетрамерный гем-содержащий фермент для детоксикации АФК, одна молекула которой инактивирует 26 миллионов молекул H₂O₂ в H₂O за 1 минуту [13]. Баланс между накоплением и погашением H₂O₂ имеет большое значения для выживания клеток, ибо это может привести к гибели клетки растений. В ряде работ отмечалось увеличение активности каталазы в ответ на тепловой стресс, и это также связано с повышением стрессоустойчивости.

В настоящем исследовании значительное увеличение активности каталазы выявили в сорте Сурхан-103 в разных диапазонах температуры (таблица 2).

Таблица 3.

Активность каталазы в листях 7 суточных проростков хлопчатника при воздействии температур (n=3;M ±m)

Самый высокий уровень активности КАТ выявлен при 45°C в сорте Сурхан-103, данном сорте активность повышалось на 218% по отношению с контрольными растениями. Однако при действии 50 ⁰C отмечалось снижение активности каталазы на 11 % по сравнению с 45 ⁰C в сорте Сурхан-103, тогда как в биотехнологических сортах активность продолжал увеличивается. При этом, активность на 44 % и 41 % повышалось в сортах Порлок-4 и Равнак-2 по отношению с 45⁰C.

А также, необходимо отметить, что скорость каталазной активности была на 22% выше в сорте Порлок-4 по сравнению с Равнак-1.

Повышенная активность каталазы при термической обработке выявлена у генотипов растений T. Aestivum [10].  у Casaurina equisetifolia, Acacia retinodes [15].  Они сообщают, что в этих сортах каталаза действует в качестве главного антиоксидантного фермента в листьях в условиях окислительного стресса вызванной тепловым шоком. Кроме того, мы не выявили большую разницу при 35° C в биотехнологических сортах по сравнению с конрольными образцами. Аналогичные результаты были обнаружены в исследованиях [1]. где активность КAT в листьях хлопчатника значительно увеличивалась (45,86%) при температуре 45 ° C, но не отмечалось достоверных различий между контролем и образцами подвергнутых к закаливающим эффектам температуры 38°C.

Полученные нами результаты выявили повышение активности ПО с увеличением температуры, однако значительные показатели обнаружены при 45°C (табл.3) Высокий уровень активности ПО отмечалось в сорте Сурхан-103 при 45°C по сравнению с контрольными образцами. А так же, в сорте Равнак-1 выявлена высокая активность данного фермента при 45°C, что составляет повышение на 79,6% в сравнении с контрольными образцами.

Таблица 4.

Активность пероксидазы в листях 7 суточных проростков хлопчатника при воздействии различных температур (n=3;M ±m)

Однако при 50°C в биотехнологических сортах, особенно в сорте Порлок-4 отмечено снижение максимальная снижения активности ПО по сравнению с контролем Аналогичные результаты получены в работах [15].  что оценка антиоксидантного статуса три вида растения измеренной в листьях (C.equisetifolia, A.retinodes и B.orientalis) показали разные значения активности ферментов (КАТ и ПО) в условиях теплового стресса. В этой же статье сообщается что КАТ действует как главный антиоксидантный фермент в листьях C.equisetifolia и A.retinodes тогда как ПО в листьях B.orientalis был более важным ферментом в условиях окислительного стресса.

Таким образом, настоящее исследование ясно продемонстрировало прогрессивное увеличение пероксида водорода параллельно с антиоксидантными ферментами КАТ и ПО вызванной повышением температуры. А также, было выявлено что каталазная активность двукратно возросла по сравнению с пероксидазной активностью в ответ на тепловой стресс. Кроме того, в сорте Равнак-1 наблюдалось повышения активности ПО параллельно с накоплением пероксида водорода в ответ на тепловой стресс.

Наиболее высокая активность КАТ по сравнению с ПО в ответ на тепловой шок наблюдалась у Порлок-4. Очевидно, высокая активность КАТ в сорте Порлок-4 может быть связан с повышением пероксида водорода. В литературе имеются данные что КАТ имеет очень высокие скорости реакций, но низкое сродство к перекиси водорода, поэтому требует больших количеств субстрата [11]. и кинетические параметры КАТ определяются скоростью доставки субстрата к активному центру [23].

Проведённый в лаборатории дисперсионный анализ по непараметрическому методу Краскела-Уоллиса показал, что для определения сходства и различия активностей ферментов в соответствующих температурных режимах (35, 45, 50°C) и в трёх сортах (Бухара-102, Порлок-1, Равнак-1), все одноимённые показатели температурного режима по всем ферментам статистически достоверно различались с уровнями значимостей в пределах P<0,002 и P<0,01 [26].

Коэффициенты корреляций в средней и высокой степени, вычисленные программой непараметрического метода Тау-Кендалла во всех трёх сортах хлопчатника и в каждом из сравниваемых антиоксидантных ферментов, встречались от 52% до 80% случаях под средним и высоком степенями подразумевается значения коэффициентов корреляций в интервалах 0,400 – 0,790 и 0,800 – 1,000 соответственно [22].

Таким образом, на основании полученных результатов следует отметить, что сортовые различия исследуемых сортов хлопчатника связаны с активностью антиоксидантных ферментов и накоплением активной форм кислорода что подтверждает тесный связь активной форм кислорода с активностью антиоксидантных ферментов. 

Авторы приносят искреннее благодарность в Центру геномики и биооинформатики АН РУз и Институту Селекции, семеноводства и агротехнологии выращивания хлопка МВСХ Руз за любезно предоставленные семяна хлопчатника.

Список литературы:

1. Atilla Gür 1, Ufuk Demirel, Mustafa Özden , Abdullah Kahraman  and Osman Çopur// Diurnal gradual heat stress affects antioxidant enzymes, proline accumulation and some physiological components in cotton (Gossypium hirsutum L.)// African Journal of Biotechnology Vol. 9(7), pp. 1008-1015, 15 February, 2010 
2. Almeselmani,  M.;  Deshmukh,  P.S.;  Sairam,  R.K.  High  temperature  stress  tolerance  in  wheat genotypes: role of antioxidant defence enzymes. Acta Agron. Hung. 2009, 57, 1–14.
3. Bandi, V., Shanker, A.K., Shanker, C., Mandapaka, M., Eds.; Springer: Berlin, Germany, 2012;pp. 261–316.
4. Beauchamp C., Fridovich I. 1971. Superoxide dismutase: Improved assays applicable to acrylamide gels. – Anal. Biochem. 44(1): 276–287.
5. Gupta, N.K, Agarwal, S., Agarwal, V. P., Nathawat, N.S., Gupta, S., Sinh, G., 2013 effect of short term heat stress and growth , physiology and antioxidative defence system in wheat seedlings. Acta phsiol plant 35, 1837-1842
6. Hasanuzzaman, M.; Hossain, M.A.; Teixeira da Silva, J.A.; Fujita, M. Plant responses and tolerance to abiotic oxidative stress: Antioxidant defense is a key factor. In Crop Stress and its Management: Perspectives and Strategies;
7. Harsha A., Y.K. Sharma, U. Joshi, S. Rampuria, G. Singh, S. Kumar, R. Sharma Effect of short-term heat stress on total sugars, proline and some antioxidant enzymes in moth bean ( Vigna aconitifolia ) //Annals of agricultural science (2016) 6 (1) 1 57-64
8. He, Y., Huang, B., 2010. Differential responses to heat stress in activities and isozymes of four antioxidant enzymes for two cultivars of Kentucky bluegrass contrasting in heat tolerance. J.Am. Soc. Hort. Sci. 135, 116–124.
9. Huang B,  Liu  X,  Xu Q (2001). Supraoptimal soil temperatures induced oxidative stress in leaves  of creeping bentgrass cultivars differing in heat tolerance, Crop Sci. 41: 430-435.
10. Kele, Y., Oncel, I. Response of antioxidative defence system to temperature and water stress combinations in wheat seedlings. Plant Sci., 163, 783-790,2002.
11. König, J., Baier, M., Horling, F., Kahmann, U., Harris, G., Schürmann, P., Dietz, K. J. (2002). The plant-specific function of 2-Cys peroxiredoxin-mediated detoxification of peroxides in the redox-hierarchy of photosynthetic electron flux. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(8), 5738-5743.
12. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. P. 265-275.
13. Li, T., R.M. Horton, D.A. Bader, F. Liu, Q. Sun, and P.L. Kinney, 2018: Long-term projections of temperature-related mortality risks for ischemic stroke, hemorrhagic stroke, and acute ischemic heart disease under changing climate in Beijing, China. Environ. Intl., 112, 1-9, doi:10.1016/j.envint.2017.12.006.
14. Mahmoud H. Hadwan New Method for Assessment of Serum Catalase  Activity Indian Journal of Science and Technology, Vol 9(4), January 2016
15. Malika Rached-Kanouni, Lamia Kehal, Chaima Touaba, Rima Bouzobra, Fadhila Belghit//change in activity of antioxidative enzymes in leaves of acacia retinodes, biota orientalis and sasaurina equisetifolia under heat stress condition//European scientific journal 2013
16. Noctor, G., De Paepe, R., and Foyer, C. H. (2007). Mitochondrial redox biology and homeostasis in plants. Trends Plant Sci. 12, 125–134.doi:10.1016/j.tplants.2007.01.005
17. Ozden  M,  Demirel  U,  Kahraman  A  (2009).  Effects  of  proline  on antioxidant system in leaves  of  grapevine (Vitis vinifera  L.)  exposed to oxidative stress by H 2 O 2 , Scientia Horticulturae 119(2): 163-168.
18. Ratnayaka  HH,  Molin  WT,  Sterling  TM  (2005).  Physiological  and antioxidant  responses  of  cotton  and  spurred  anoda  under interference and mild drought, J. Exp. Bot. 54(391): 2293-2305.
19. Sajid Majeed, Tanwir Ahmad Malik, Iqrar Ahmad Rana, Muhammad Tahseen Azhar// Antioxidant and physiological responses of uplound cotton accessions grown under high temperature regimes//Iranian journal of science and technologies Trans action A, science 43(5) 2019
20. Velikova, V., I. Yordanov, and A. Edreva. Optimized Assay for Hydrogen Peroxide Determination in Plant Tissue Using Potassium Iodide American Journal of Analytical Chemistry, 2014, 5, 730-736
21. Yan, J., Tsuichihara, N., Etoh, T., and Iwai, S. (2007). Reactive oxygen species and nitric oxide are involved in ABA inhibition of stomatal opening. Plant Cell Environ. 30, 1320–1325
22. Бююль А., Цеффель П. SPSS: искусство обработки информации. – М., 2005. Глава 11. Корреляционный анализ.
23. Донцов, В. И., Крутько, В. Н., Мрикаев, Б. М., Уханов, С. В. (2006).//Активные формы кислорода как система: значение в физиологии, патологии и естественном старении. Труды института системного анализа российской академии наук, 19, 50-69
24. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. С.41-43.
25. Колупаев, Ю.Е. ; Карпец, Ю.В.//Активные формы кислорода при адаптации растений к стрессовым температурам// физиология и биохимия культ. Растений. 2009. Т.41.№ 2
26. Наследов, А.Д. SPSS 19. Профессиональный статистический анализ данных [Текст] / А. Д. Наследов. – СПб.: Питер, 2011. – 400 с.
27. Прудников П.С., Гуляева А.А., //Влияние гипертермии на гормональную систему и антиоксидантный статус Prunus cerasus L//Современное садоводство//электронный журнал 2015