МИНИМАЛЬНАЯ ИНГИБИРУЮЩАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ И АНТИБИОПЛЕНОЧНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНДОФИТНОГО ГРИБА Penicillium roqueforti 12Ph, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РАСТЕНИЯ Peganum harmala

АННОТАЦИЯ

Изучены минимальная ингибирующая концентрация (МИК) суммарного экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph, ингибирующее действие патогенных микроорганизмов на формирование биопленки и разлагающее действие на образующуюся биопленку. Установлено, что минимальная ингибирующая концентрация экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph составляет 25 мкг/мл в отношении патогенов St. aureus, B. subtilis, C. albicans. Ингибирующее действие суммарного экстракта штамма на образование биопленок St. aureus, MRSA и C. albicans составил 80%, 49% и 92% соответственно.

ABSTRACT

The minimum inhibitory concentration (MIC) of the total extract of the strain Penicillium roqueforti 12Ph, which inhibits the action of pathogenic microorganisms on the formation of a biofilm and decomposes the effect on the resulting biofilm, was studied. It was found that the minimum inhibitory concentration of the extract of the strain Penicillium roqueforti 12Ph is 25 µg/ml against pathogens (St. aureus, B. subtilis, C. albicans). Its total extract inhibited St. aureus biofilm formation by 80%, MRSA by 49% and C. albicans by 92%.

Ключевые слова: минимальная ингибирующая концентрация, формирование биопленки, Penicillium roqueforti, St. aureus, B. subtilis, C. albicans, Peganum harmala,

Keywords: minimal inhibitory concentration, biofilm formation, Penicillium roqueforti, St. aureus, B. subtilis, C. albicans.

Введение

Показатель МИК впервые внедрено в науку после открытия антибиотиков. Повышение резистентности возбудителей к антибиотикам требует широкого применения МИК в клинической практике. При введении в организм концентрации антибиотика, недостаточной для полного устранения возбудителя, происходит выживание определенной части патогена, которая приобретает резистентность к применяемому антибиотику [1, с. 2]. После образования патогенными микроорганизмами биопленки на внутренних поверхностях тела человека или животного, их устойчивость к различным лекарственным препаратам и антибиотикам возрастает до 1000 раз [2, с. 149–161], что в свою очередь, негативно сказывается на эффективности применяемых лекарственных средств. При этом комбинированное применение веществ, разрушающих и препятствующих образованию биопленки, повышает эффективность применяемых методов терапии. В связи с вышеизложенным целью нашего исследования явилось изучение минимальной ингибирующей концентрации суммарного экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph, его влияния на формирование патогенной биопленки и разлагающего эффекта на образовавшуюся биопленку.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали штамм эндофитного гриба Penicillium roqueforti 12Ph, выделенный из растения Гармала обыкновенная (Peganum harmala), произрастающего в Самаркандской области Республики Узбекистан. Этот штамм зарегистрирован в «Коллекции важных микроорганизмов для промышленности» Института микробиологии АН РУз под номером «9Е» и включен в международную базу данных NCBI как Penicillium roqueforti 12Ph (MZ424749). Минимальную ингибирующую концентрацию суммарного экстракта вторичных метаболитов, полученных из этого штамма, определяли методом Кирби-Бауэра [3, с. 1–20] с некоторыми модификациями. Бактериальные суспензии вводили в мясо-пептонную агаризованную среду в чашке Петри. После высушивания при комнатной температуре в течение 15 минут открывались лунки размером 10 мм. Готовили разные концентрации экстрактов (1000-25мкг/мл) и заливали в лунки. Зону ингибирования, образовавшуюся после инкубации в течение 24 ч при 37°С, измеряли в миллиметрах (табл. 1).

Таблица 1.

Пример определения минимальной ингибирующей концентрации суммарного экстракта Penicillium roqueforti 12Ph против патогена St.aureus 96

Здесь: Cons (мкг/мл) - разные концентрации экстракта;

Log Cons – логарифм концентраций;

а (мм) - общая площадь ингибирования;

b (мм) - диаметр диска или лунки;

X (мм) – длина от края диска или лунки до края зоны ингибирования;

Х2 (мм) — квадрат длины от края диска или лунки до края зоны ингибирования.

Помещая значения Log Cons и X² мм в декартову систему координат, находят минимальную ингибирующую концентрацию испытуемого экстракта.

Примечание: Расчет МИК против 4 остальных патогенов, также было осуществлено по данной схеме.

Исследование антибиопленочной активности экстрактов было произведено, согласно ранее описанному методу, с некоторыми модификациями[4, с. 2901–2911]. Подтверждение способности исследуемых патогенных микроорганизмов к образованию биопленки было произведено предварительным высеванием в 10мл мясо-пептонного бульона, суспензии каждого из возбудителей и инкубированием в течение 24 часов. Затем жидкости в пробирке сливали и осторожно промывали деионизированной водой, после чего пробирки были высушены и окрашены 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 1 минуты. После удаления красителя пробирки промывали деионизированной водой и высушивали. Сохранение цветных колец на стенке пробирки свидетельствует об образовании биопленки.

Ингибирующее действие экстрактов на образование биопленки: данный опыт был произведен на микротитровальном планшете в которую была внесена суспензия патогенного микроорганизма, затем добавлен экстракт в МИК, растворенный в ДМСО, в качестве положительного контроля – антибиотик, в качестве отрицательного контроля – мясопептонный бульон в объеме 100мкл. Через 24 часа инкубации суспензии сливались, промывались и окрашивались в течение 1 минуты. После удаления красителя промывали и высушивали. Далее вносили 125 мкл 100% этилового спирта, по истечении 15 минутной инкубации при комнатной температуре определяли оптическую плотность спирта в лунках спектрофотометрическим методом при 590 нм.

Процент ингибирования (%_i) был рассчитан по формуле:

Разлагающее действие экстрактов на существующую биопленку исследовалось согласно вышеописанному методу. Однако отличие состоит в том, что лунки титрационного микропланшета сначала заполняли взвесями патогенных микроорганизмов, а по истечении 24 часов инкубации проводили опыты и контроль.

Результаты исследования

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) является важным параметром в процессе определения антибактериальных свойств веществ. МИК считается основным лабораторным показателем при определении антимикробной активности антибактериальных соединений. Низкое значение МИК указывает на то, что для ингибирования роста микроорганизма требуется меньше препарата, а это означает, что препараты с низким значением МИК эффективны против микробов. В настоящее время разработано несколько электронных баз данных МИК, в которых параметры МИК важны в диагностических лабораториях для определения резистентности микроорганизмов к антибактериальным соединениям, а также для контроля активности новых антимикробных средств. Таким образом, индекс МИК помогает лечить больных и предотвращать развитие резистентных к лекарственным препаратам штаммов микробов [1]. Для изучения минимальной ингибирующей концентрации суммарного экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph, сухой суммарный экстракт биомассы растворяли в ДМСО до различных концентраций (1000-25 мкг/мл) и изучали их антибактериальную активность в отношении пяти условно-патогенных микроорганизмов. (табл. 2, рис. 1).

Таблица 2.

Определение минимальной ингибирующей концентрации Penicillium roqueforti 12Ph

Рисунок 1. Определение минимальной ингибирующей концентрации Penicillium roqueforti 12Ph

В результате установлено, что показатель МИК экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph варьировал в отношении различных патогенов. Наименьшее значение наблюдалось в отношении условного возбудителя St.aureus 96, B.subtilis 91 и C.albicans 84, по 25 мкг/мл. в отношении E.coli 86 и Ps.aeruginosa 75 были получены относительно высокие значения МИК: 100мкг/мл и 400мкг/мл соответственно. В научных источниках приводятся значения МИК наиболее широко применяемых на практике антибиотиков, в частности, препарат Цефтриаксон имеет МИК 0,12 мг/мл по отношению к E.coli, от 4 до 64 мг/л для St. aureus [6, с. 103]. МИК флуконазола составляет около 0,25–32 мкг/мл для C. albicans [7, с. 3]. На основании этих данных можно сказать, что суммарный экстракт штамма Penicillium roqueforti 12Ph имеет наименьшую МИК 25 мкг/мл против возбудителей St.aureus, B.subtilis, C.albicans.

Образование биопленок патогенными микроорганизмами на внутренних поверхностях тела человека или животных снижает эффективность антибиотиков в несколько тысяч раз, тем самым повышая потребность в веществах, обладающих эффектом остановки образования новых биопленок и разрушения образовавшейся биопленки. [2, с. 149–161]. Поэтому мы поставили цель изучить ингибирующее действие суммарного экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph на биопленкообразование патогенных микроорганизмов и разлагающее действие на образовавшуюся биопленку. В качестве патогенных микроорганизмов были применены St.aureus 96, метициллинрезистентный Staphylococcus aureus 97 (MRSA 97), C.albicans 84. Использовали минимальные ингибирующие концентрации общего экстракта штамма Penicillium roqueforti 12Ph. В качестве положительных контролей были применены цефтриаксон против патогенов St.aureus 96 и метициллинрезистентный Staphylococcus aureus 97 (MRSA 97) и флуконазол против патогена C.albicans 84(табл. 3).

Таблица 3.

Ингибирующее действие суммарного экстракта Penicillium roqueforti 12Ph на формирование биопленок патогенных микроорганизмов

Примечание: O.D– приведены значения оптической плотности

Из полученных результатов можно сказать, что суммарный экстракт Penicillium roqueforti 12Ph обладает высокой ингибирующей активностью. В частности, если цефтриаксон ингибировал образование биопленки St.aureus на 90,9%, то суммарный экстракт ингибировал на 80%. При MRSA показатель экстракта (49%) был почти в два раза выше, чем у антибиотика (26,5%). У C.albicans наш экстракт показал самый высокий результат (92%), при показателе флуконазола 60,8%.

Для изучения разлагающего действия экстракта на образующуюся биопленку образцы и контроли помещали на инокулированную лунку после 24 часов инкубации и инкубировали еще 24 часа. Результаты, полученные после инкубации, рассчитывали по вышеописанной формуле(табл. 4).

Таблица 4.

Разлагающее действие суммарного экстракта Penicillium roqueforti 12Ph на биопленку, продуцируемую патогенными микроорганизмами

Примечание: O.D– приведены значения оптической плотности

На основании приведенной выше таблицы можно сказать, что результаты значительно отличаются от результатов предыдущих экспериментов. Хотя суммарный экстракт Penicillium roqueforti 12Ph обладает высоким ингибирующим действием на образование биопленок патогенными микроорганизмами, его деструктивное действие на формирующуюся биопленку несколько ниже. Например, хотя биопленка St.aureus почти не разрушалась (1,5%), ее ингибирующий эффект составлял около 80%. Тот факт, что только 12,2% биопленок MRSA деградируют, показывает, что ингибирующий эффект почти в 4 раза выше при воздействии на образующуюся, чем на уже сформировавшуюся биопленку. Однако можно понять, что эти показатели являются естественными для антибактериальных средств по сравнению с положительным контролем цефтриаксона. Для C.albicans также разница между процентом ингибирования образования и процентом деструктивного действия составляла около 9 раз. При применении флуконазола эти показатели снижались почти 2,5 раза. Биопленка представляет собой сложную комбинацию микроорганизмов, которая не поддается легкому воздействию и разрушению. Наши результаты подтверждены в научных источниках. Каур и [4, с. 2906] в работе других групп ученых, установивших, что суммарный экстракт A. fumigatus, полученный в хлороформе, обладал несколько большей ингибирующей активностью в отношении биопленкообразования. В частности, для C.albicans эффективность против образования клеток была лучше (55%), чем у амфотерицина В (53%). Экстракт также ингибировал St.aureus на 69,2%, в то время как положительный контроль - гентамицин ингибировал на 72%. Однако ингибирующая активность экстракта грибов и контролей амфотерицина В, гентамицина в отношении сформированной биопленки была несколько ниже, чем в отношении биопленкообразования. Высокая активность ингибирования биопленкообразования объясняется тем, что вещество угнетает процессы размножения и взаимодействия микроорганизмов [8, с. 836–838].

Выводы

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что суммарный экстракт штамма Penicillium roqueforti 12Ph имеет высокий показатель МИК 25 мкг/мл в отношении возбудителей St.aureus, B.subtilis, C.albicans, его общий экстракт может быть основой для профилактических препаратов против образования биопленок патогенными микроорганизмами.

Список литературы:

1. The Minimum Inhibitory Concentration of Antibiotics: Methods, Interpretation, Clinical Relevance.
2. T. B. Rasmussen and M. Givskov, “Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenic drugs,” Int J Med Microbiol, vol. 296, no. 2–3, pp. 149–161, Apr. 2006, doi: 10.1016/j.ijmm.2006.02.005.
3. Kirby-Bauer-Disk-Diffusion-Susceptibility-Test-Protocol-pdf.pdf. Accessed: Oct. 29, 2021. [Online]. Available: https://asm.org/getattachment/2594ce26-bd44-47f6-8287-0657aa9185ad/Kirby-Bauer-Disk-Diffusion-Susceptibility-Test-Protocol-pdf.pdf
4. N. Kaur, D. S. Arora, N. Kalia, and M. Kaur, “Antibiofilm, antiproliferative, antioxidant and antimutagenic activities of an endophytic fungus Aspergillus fumigatus from Moringa oleifera,” Mol Biol Rep, vol. 47, no. 4, pp. 2901–2911, Apr. 2020, doi: 10.1007/s11033-020-05394-7.
5. W. Lowman, N. Aithma, A. G. Duse, and M. Mer, “Comparative MIC evaluation of a generic ceftriaxone by both microdilution on clinically relevant isolates from an academic hospital complex in South Africa,” South African Medical Journal, vol. 102, no. 2, Art. no. 2, Jan. 2012.
6. F. Eksi, E. D. Gayyurhan, and I. Balci, “In Vitro Susceptibility of Candida Species to Four Antifungal Agents Assessed by the Reference Broth Microdilution Method,” The Scientific World Journal, vol. 2013, p. 236903, Oct. 2013, doi: 10.1155/2013/236903.
7. P. S. Stewart et al., “Effect of Catalase on Hydrogen Peroxide Penetration into Pseudomonas aeruginosa Biofilms,” Appl Environ Microbiol, vol. 66, no. 2, pp. 836–838, Feb. 2000.