ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА БАКТЕРИЙ – ПРОДУЦЕНТА АМИДАЗЫ

АННОТАЦИЯ

С целью выделения активных штаммов микроорганизмов, способных трансформировать нитрилы, были проанализированы 11 образцов сточных вод, ила и почвы, загрязненных нитрилом акриловой кислоты, акриламидом акриловой кислоты, с территории АО «Navoiyazot» (г. Навои, Узбекистан). В результате выделены в чистую культуру 19 штаммов, относящихся к бактерии рода Rhodococcus. В процессе селекции отобраны 2 штамма бактерий, проявляющих наиболее высокую амидазную активностью по акриловой кислоте (0.712 Ед/мг и 0.868 Ед/мг). Выделенные в чистую культуру штаммы Rhodococcus sp. – 8/4/1 и Rhodococcus sp. – 3/4/3 являются потенциальными продуцентами амидазы. Дальнейшее усовершенствование данных штаммов послужит получению потенциального биокатализатора для биокаталитического синтеза акриловой кислоты.

ABSTRACT

In order to isolate active strains of microorganisms capable of transforming nitriles, 11 samples from wastewater, silt and soils contaminated with acrylonitrile, acrylamide and acrylic acid were taken from territory of «Navoiyazot» JSC (Navoiy, Uzbekistan) and analyzed. As a result, 19 strains belonging to the bacteria of the genus Rhodococcus have been isolated into a pure culture. In the process of selection, 2 bacterial strains were selected showing the highest amidase activity (0.712 and 0.868 U/mg). Thus, the strains of Rhodococcus sp. – 8/4/1 and Rhodococcus sp. – 3/4/3 isolated in pure culture are potential producers of amidase. Further improvement of these strains will serve to obtain a potential biocatalyst for the biocatalytic synthesis of acrylic acid.

Ключевые слова: штамм, амидаза, активность фермента, акриловая кислота, биокатализ.

Keywords: strain, amidase, enzyme activity, acrylic acid, biocatalysis.

В настоящее время возрастает интерес к использованию алканотрофных родококков в различных биотехнологических процессах. Активные и стабильные штаммы родококков нашли практическое применение в получении амидов и их производных, субстанций для фармпрепаратов, биоремедиации окружающей среды от ксенобиотиков, в системе очистки углеводородного загрязнения биосферы, очистке сточных вод и почв от загрязнителей. Родококки обладают высоким уровнем адаптации к экстремальным условиям существования [11; 12], характеризуются такими уникальными биологическими свойствами, как плеоморфизм, способность к коагрегации, имеют сложный морфогенетический цикл развития, и эти характеристики обусловливают у них наличие разнообразных способов клеточной кооперации [1]. Кооперация способствует установлению контакта клеток друг с другом, их удержанию в колониях, адсорбции на поверхности капель гидрофобных субстратов и почвенных частиц, а также образованию на поверхности носителей биопленок, использующихся в биотехнологических процессах. За счет фрагментации клеточного мицелия родококков на короткие палочковидные формы увеличивается отношение клеточной поверхности к общему объему клетки, что, в свою очередь, повышает способность родококков поглощать трудноусваиваемый гидрофобный субстрат [6].

Родококки были выделены из различных источников, таких как почва, грунтовые воды, морские отложения, внутренние органы насекомых, больных и здоровых животных или растений [11; 12; 13]. Подавляющее большинство этой группы бактерий считается безвредным, однако некоторые виды проявляют патогенные свойства, приводящие к пневмонии жеребят (R. equi) или листовой болезни у растений (R. fascians). Начиная с 1980-х годов бактерии рода Rhodococcus нашли широкое применение в качестве биокатализаторов, и использование их в реакциях биокатализа вышло на первый план. Они находят широкое применение в биоконверсии различных органических субстратов [9]. Многолетний синтез акриламида (АА) в большом масштабе, запущенный на нескольких производственных площадках по всему миру, рассматривается как наиболее выдающийся пример клеточного процесса для этой группы бактерий, а также возможность применения в качестве биокатализаторов для получения других полезных химических продуктов, в частности акриловой кислоты (АК). АК является сырьем для получения полимеров и сополимеров различного назначения, широко применяемых во всех сферах народного хозяйства [7; 8; 14; 5].

В связи с этим целью настоящей работы являются выделение местных штаммов бактерий – продуцентов нитрилтрансформирующих ферментов, в частности амидазы, и оценка возможности их использования для получения АК.

Материалы и методы исследования

Для выделения микроорганизмов с нитрилгидратазной и амидазной активностью были использованы сточные воды, ил и почва, загрязненная нитрил акриловой кислотой (НАК), АА и АК АО «Navoiyazot» (г. Навои, Узбекистан).

Штаммы выделяли методом накопительной культуры и прямого высева. В случае прямого высева навески почвы 10 г суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера, отстаивали при температуре 25–27 °С в течение 1 часа, надосадочную жидкость в количестве 100 мкл наносили на поверхность агаризованной среды питательный агар (Himedia, Индия), содержащий ацетонитрил в концентрации 2–5%, акрилонитрил в концентрации 0.1–1%, и растирали шпателем. В качестве образцов ила или стоков образцы не разводили в фосфатном буфере, высев производили напрямую в питательный агар.

Для выращивания накопительных культур и выделения нитрилконвертирующих штаммов микроорганизмов 10 г или 10 мл образца вносили в питательные среды: триптон-соевый бульон (Himedia, Индия) или пептонсодержащая (ПС) среда (г/л): пептон – 5.0, KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄*7H₂O – 0.5, NaCl – 0.5, CoCl₂*6H₂O – 0.01 и глюкоза – 10.0 с добавлением ацетонитрила и акрилонитрила, рН среды – 7.0–7.3. Выращивали в конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 70 мл питательной среды, на электромагнитной качалке с круговым вращением (120 об/мин) при 28–30 °С. Колбы инкубировали в течение 7 дней, периодически отбирая пробы с последующим высевом их на чашки.

Для селекции штаммов бактерий продуцентов нитрилгидратаз и амидаз на твердой питательной среде использовали АА, акрилонитрил (НАК), ацетонитрил.

Для получения чистой культуры отбирали морфологически различающиеся колонии и проверяли их однородность двукратным пересевом на питательный агар. Чистота культур контролировалась высевом на агаризованную среду питательный агар.

Идентификация штаммов проводилась на основании культурально-морфологических и биохимических характеристик согласно определителю Берджи, руководствам И.Б. Ившиной и О.А. Нестеренко [11; 12; 3].

Морфологию и жизненный цикл штаммов изучали в течение 6, 12, 18, 48, 72 часов культивирования на питательном агаре (HIMEDIA) и жидкой питательной среде ПС с использованием световой микроскопии.

Оптическую плотность клеточной суспензии (ОП) определяли на спектрофотометре UV-5100 (Metash, Китай) с использованием 10 мм кюветы. Бактериальный рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при λ=540 нм с учетом разведения. Путем взвешивания на аналитических весах полученную центрифугированием клеток массу в течение 10 мин при 12000 об/мин высушивали биомассу до постоянной массы клеток определяли абсолютно сухую биомассу.

Трансформацию НАК в АА и АК проводили с использованием биомассы исследуемых штаммов, выращенных предварительно в жидкой питательной среде ПС, в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7.5, с концентрацией НАК 1–2%. Реакцию проводили при температуре 20–25 °С в течение 10 и 30 мин и останавливали добавлением 0.1 мл 1 н. НСl. Пробы центрифугировали при 12000 об/мин в течение 7 мин. Концентрацию АА и АК определяли в надосадочной жидкости с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе LKB HPLC system, используя колонку Силосорб SPHC₁₈ (150*4 мм, 8 мкм) или DISCOVERY-C₁₈ (75*4 мм, 5 мкм), давление – 0,9–1,0 атм., УФ-детектор-фильтром 206 нм, потоком подвижной фазы 1 мл/мин следующего состава: 10 мМ фосфатный буфер или dH₂O – 97%, CH₃CN – 3%, рН = 2.5. В качестве контроля использовали серийные разведения чистых препаратов НАК, АА и АК.

Результаты и их обсуждение

Для выделения активных штаммов микроорганизмов, способных трансформировать нитрилы, были проанализированы образцы сточных вод, ила и почвы, загрязненных НАК, АА и АК. Отбор проб проводился с территории производства АО «Navoiyazot» на площадях, на которых находятся производственные мощности по производству НАК и АА. С целью выделения активных штаммов, способных трансформировать НАК в АА и АК, были проанализированы 11 образцов.

Отдельные колонии микроорганизмов выделяли методом накопительной культуры и прямого высева. В результате из образцов сточных вод, ила и почвы были выделены в чистую культуру 19 штаммов.

Выделенные штаммы представляли гомогенную группу микроорганизмов и различались однотипностью фенотипических свойств, включая морфологию колоний и микробных клеток. Все исследуемые штаммы – грамположительные аэробы, неподвижны, некислотоустойчивые, неспорообразующие. Клетки палочковидные, слабо ветвящиеся. Характерно V-образное расположение клеток. Отличительная особенность исследуемых штаммов – трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки – палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки). На питательном агаре при температуре 28 °С, рН = 7.0 образуют колонии мягкой консистенции без воздушного мицелия с розовым, темно-розовым, оранжево-красным недиффундирующим пигментом. На основании морфолого-культуральных свойств выделенные штаммы отнесены к роду Rhodococcus.

Выделенные в чистую культуру штаммы бактерий, относящиеся к роду Rhodococcus, были изучены на способность синтезировать амидазу. Способность выделенных штаммов бактерий рода Rhodococcus трансформировать НАК в АА и АК изучали с использованием биомассы клеток. Культуры выращивали на жидкой питательной среде ПС в течение 72–96 часов, затем клетки осаждали центрифугированием, осадок использовали на способность культур трансформировать НАК в АА и АК.

В результате проведенного скрининга отобраны 2 штамма с амидазной активностью по акриловой кислоте. Установлено, что штаммы Rhodococcus sp. – 8/4/1 и Rhodococcus sp. – 3/4/3 синтезируют амидазу с активностью 0.712 Ед/мг и 0.868 Ед/мг соответственно. Известно, что некоторые штаммы родококков, такие как R. rhodochrous M-33 и R. ruber GT1, обладают высокой нитрилгидролизующей активностью, которая определяла их применение в промышленном синтезе акриламида [2; 4].

В процессе биотрансформации НАК в среде обнаруживались акриламид и акриловая кислота. Это позволило установить наличие у штамма нитрилгидратазно-амидазного пути метаболизма, т.е. ферментная система нитрилгидратаза/амидаза штамма Rhodococcus sp. – 8/4/1 превращает НАК в АК в две стадии: нитрилгидратаза превращает НАК в АА, который далее под действием амидазы превращается в АК.

Таблица 1.

Скрининг амидазной активности выделенных штаммов бактерий рода Rhodococcus

Таким образом, выделенные в чистую культуру штаммы Rhodococcus sp. – 8/4/1 и Rhodococcus sp. – 3/4/3 являются потенциальными продуцентами амидазы. Дальнейшее усовершенствование данного штамма послужит получению потенциального биокатализатора для биокаталитического синтеза акриловой кислоты.

Список литературы:

1. Биотехнологический потенциал биодеградации Rhodococcus / D. Kim, K.Y. Choi, M. Yoo, G.J. Zylstra [et al.] // J. Microbiol. Biotechnol. – 2018. – Vol. 28 (7). – P. 1037–1051.
2. Максимова Ю.Г. Биотрансформация акрилонитрила иммобидизованнқми клетками актинобактерии рода Rhodococcus : дис. … канд. биол. наук. – Пермь, 2006. – 127 с.
3. Нестеренко О.А., Красников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные нокардиоформные бактерии. – Киев : Наукова думка, 1985. – С. 336.
4. Способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M-33, продуцирующего нитрилгидратазу // Патент RU 2340667.
5. Aliphatic Amidase of Rhodococcus Rhodochrous PA-34 / Neerja Thakur, Vijay Kumar, Nirmal Kant Sharma, Shikha Thakur [et al.] // Purification, Characterization and Application in Synthesis of Acrylic Acid Protein Pept Lett. – 2016. – № 23 (2). – P. 152–158.
6. Alvarez H.M. Biology of Rhodococcus. 2nd ed. – Springer : Basel, Switzerland, 2019.
7. Biocatalysis explained: From Pharmaceutical to Bulk Chemical Production / E.M.M. Abdelraheem, H. Busch, U. Hanefeld, F. Tonin // React. Chem. Eng. – 2019.
8. Development of biocatalytic processes in Japan and Germany: From research synergies to industrial applications / H. Gröger, Y. Asano, U.T. Bornscheuer, J. Ogawa // Chem. Asian J. – 2012. – № 7. – P. 1138–1153.
9. Genome analysis and -omics approaches provide new insights into the biodegradation potential of Rhodococcus / J. Zampolli, Z. Zeaiter, A. Di Canito, P. Di Gennaro // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2019. – № 103. – P. 1069–1080.
10. Gimadutdinov O.A., Kayumov A.R. Workshop on Molecular Genetics. Study guide. – Kazan, KFU, 2016. – P. 36.
11. Ivshina I.B. The genus Rhodococcus bacteria: biodiversity, detection, immunoassay // Doctoral thesis. – Perm, 1997.
12. Ivshina I.B., Kamenskikh T.N., Anokhin B.A. Adaptive mechanisms of alkanotrophic rhodococci survival under unfavorable conditions // Bulletin of Perm University. – 2007. – Vol. 5 (10). – Р. 107–112.
13. Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.C.R. Biodegradation by Members of the Genus Rhodococcus // Biochemistry, Physiology, and Genetic Adaptation. Adv. Appl. Microbiol. – 2006. – № 59. – P. 1–29.
14. Ogawa J., Shimizu S. Industrial microbial enzymes: Their discovery by screening and use in large-scale production of useful chemicals in Japan // Curr. Opin. Biotechnol. – 2002. – № 13. – P. 367–375.