Анализ элюционных свойств природных полисахаридов в эксклюзионной хроматографии

АННОТАЦИЯ

В данной работе рассматривается элюционное поведение некоторых природных полисахаридов в эксклюзионной хроматографии в водных и водно-солевых элюентах. Исследован эффект полиэлектролитного набухания в зависимости от концентрации вводимого образца полисахарида.

ABSTRACT

 In this work, elution properties of some polysaccharides in exclusion chromatography in aqueous and aqueous-salt eluents are analyzed. Polyelectrolyte expansion effect depending on concentration of injected probe of polysaccharide was investigated.

Ключевые слова: полиэлектролитное набухание, арабиногалактан, пектин, эксклюзионная хроматография, концентрационная зависимость.

Keywords: polyelectrolyte expansion, arabinogalactan, pectin, exclusion chromatography, concentration dependence.

I. Введение

Эксклюзионная жидкостная хроматография (ЭЖХ) является экспрессным методом определения средних молекулярных масс и молекулярно-массового распределения полимеров [1]. Анализ и определение молекулярно-массовых характеристик гидрофильных полимеров в большинстве случаев требует подавления электростатических эффектов, которые нарушают молекулярно-ситовой механизм разделения ЭЖХ. При анализе в водной среде анионных полиэлектролитов, в том числе и природных полисахаридов [5], наиболее часто проявляются эффекты полиэлектролитного набухания и ионной эксклюзии. В ранних работах [6; 3] нами было исследовано в водном бессолевом растворителе элюционное поведение ксиланов, галактоглюкоманнанов и арабиногалактанов (АГ), у которых в гель-хроматограммах обнаружены асимметричные профили, указывающие на электростатические эффекты. В частности, молекулярно-ситовой механизм разделения ЭЖХ в анализе АГ с нанобиокомпозитами был реализован после подавления вышеуказанных эффектов при использовании в качестве элюента водного раствора нитрата натрия с концентрацией 0,1 моль/л [2–4]. В данной работе мы исследовали элюционные свойства пектинов, гуара и АГ фирмы Sigma Aldrich.

II. Методы исследования

ЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100/1260 с использованием системы хроматографических колонок Ultrahydrogel Linear (Waters, США). Элюентом служила вода, объемная скорость потока элюента составляла 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляли в комплексном режиме, применяя многоугловой светорассеивающий детектор (MALS, DAWN Tristar, USA), дифференциальный рефрактометр (RID10A, Shimadzu) и спектрофотометрический детектор с диапазоном длин волн 200–600 нм. Для калибровки в качестве полимерных стандартов были использованы узкодисперсные пуллуланы фирмы PSS (г. Майнц, Германия). Обработка результатов анализа проведена с помощью компьютерной программы Astra версии 5.3.4.20.

III. Обсуждение результатов

На рис. 1 представлены совмещенные гель-хроматограммы трехдетекторного ЭЖХ анализа цитрусового пектина, полученные в водном элюенте. Из рисунка видны асимметричные мультимодальные хроматограммы, зафиксированные рефрактометрическим (2) и светорассеивающим (1) детекторами из-за присутствия эффекта полиэлектролитного набухания макромолекул. Светорассеивающий детектор реагирует на геометрические размеры макромолекул, агрегаты или ассоциаты в растворах полимеров и, следовательно, выдает сильный отклик (пик) в разбавленной области концентрации раствора пектина, соответствующей в передней части хроматограммы, т.е. вблизи исключенного объема хроматографической колонки.

Рисунок 1. Копии гель-хроматограмм цитрусового пектина, полученные при концентрации вводимой пробы 2 г/л (а) и 1 г/л (б). 

Детекторы в хроматограммах: 1 – светорассеивающий (MALLS); 2 – рефрактометрический (RI); 3 – спектрофотометрический (СФД)

Рефрактометрический детектор (рис. 1а, 2-я линия) реагирует на концентрацию макромолекул в растворе, и поэтому передний фронт хроматограммы сильно растянут и задний фронт резко обрывается до базовой линии элюционной кривой. При двукратном разбавлении вводимого раствора на рефрактометрическом детекторе отчетливо видно разделение образца на две фракции, что характерно еще при более сильном проявлении эффекта полиэлектролитного набухания (рис. 1б, 2-я линия). Пектин состоит в основном из D-галактуроновых кислот, соединенных посредством α1→4-гликозидных связей (рис. 2)

Рисунок 2. Структурная формула элементарного звена пектина

В водной среде диссоциация карбоксильных групп приводит к разворачиванию цепей макромолекул пектина и тем самым к увеличению размеров макромолекул.

Схожий эффект наблюдали при хроматографировании образца АГ из лиственницы с концентрацией вводимой пробы 4, 2, 1 г/л (рис. 3, кривые 1, 2, 3), что говорит о наличии также в данной системе эффекта полиэлектролитного набухания. Макромолекула АГ из древесины лиственницы имеет высоко разветвленное строение; главная цепь ее состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями β-(1→3), а боковые цепи со связями β-(1→6) – из звеньев галактозы и арабинозы, из единичных звеньев арабинозы, а также уроновых кислот, в основном глюкуроновой. За счет диссоциации карбоксильных групп у глюкуроновой кислоты в воде происходит набухание клубков в цепи молекул АГ, и, следовательно, с уменьшением концентрации вводимой пробы уменьшаются удерживаемые объемы, соответствующие максимуму хроматографических пиков (рис. 3, кривые 1, 2, 3).

Рисунок 3. Совмещенные гель-хроматограммы образца АГ из древесины лиственницы, полученные в воде (кривые 1, 2, 3), при концентрациях вводимых проб:

1) 4 г/л; 2) 2 г/л; 3) 1 г/л и в водном растворе нитрата натрия с концентрацией 0,1 моль/л (кривая 4). Детектор – дифференциальный рефрактометр

В водно-солевом растворе удерживаемый объем образца АГ смещается в сторону уменьшения, профиль хроматограммы становится симметричным, что свидетельствует о подавлении электростатических эффектов и наступлении молекулярно-ситового разделения ЭЖХ.

IV.Выводы

В заключение отметим, что в цепях макромолекул у большинства природных полисахаридов присутствуют ионизируемые группы, приводящие к внутримолекулярным электростатическим взаимодействиям в ЭЖХ, проявляющиеся в аномальных асимметричных элюционных кривых или состящих из нескольких пиков в гель-хроматограммах. Указанные взаимодействия энтальпийной природы подавляются добавлением в элюент (в воду) нейтральной одновалентной низкомолекулярной соли.

Благодарности

Авторы выражают глубокую благодарность д-ру хим. наук, проф. А. Пранович и проф. С. Виллфор (Университет Або Академии, Турку, Финляндия) за предоставленную возможность проведения ЭЖХ анализов полисахаридов.

Список литературы:

1. Беленький Б.Г., Виленчик Л.З. Хроматография полимеров. – М. : Химия, 1978. – 344 с.
2. Металлополимерные нанобиокомпозиты с галактосодержащими стабилизирующими матрицами: размерный эффект в изменении молекулярно-массовых характеристик / Г.П. Александрова, А.С. Боймирзаев, Б.Г. Лесничая, Б.Г. Сухов [и др.] // Журнал общей химии. – 2015. – Т. 85. – Вып. 2. – С. 317–326.
3. Модификация матрицы арабиногалактана в процессе формирования металлополимерных нанобиокомпозитов / Г.П. Александрова, А.С. Боймирзаев, И.В. Клименков, Б.Г. Сухов [и др.] // Российские нанотехнологии. – 2019. – Т. 14. – № 1–2. – С. 39–46.
4. Нанобиокомпозиты фармакофорных оксидов железа и висмута с участием матрицы арабиногалактана / Г.П. Александрова, А.Н. Сапожников, А.С. Боймирзаев, Б.Г. Сухов [и др.] // Журнал общей химии. – 2020. – Т. 90. – № 4. – С. 619–629.
5. Применение природных полисахаридов в фармацевтике / М.В. Хвостов, Т.Г. Толстикова, С.А. Борисов, А.В. Душкин // Биорганическая химия. – 2019. – Т. 45. – № 6. – С. 563–575.
6. Boymirzaev A.S., Pranovich A., Willför S. Evaluation of charged molecules content of plant polysaccharides by aqueous size exclusion chromatography // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2017. – Т. 17. – № 4. – С. 689–694.