Влияние препаратов растительного происхождения на кальциевый гомеостаз митохондрий головного мозга крыс различного возраста

АННОТАЦИЯ

В статье исследовано влияние супрамолекулярного комплекса, состоящего из глицирризиновой кислоты и кверцитина (ГК+Кв) на процесс скачка митохондриальной проницаемости (СМП) и кальциевый гомеостаз митохондрий головного мозга 9,12, и 15 месячных крыс. Установлено, что ГК+Кв увеличивает порог чувствительности митохондрий к Са²⁺ индуцированному скачку митохондриальной проницаемости 15 месячных крыс, не оказывая влияния на трансмембранный потенциал митохондрий.

ABSTRACT

In the article influence of a supramolecular complex consisting of glycyrrhizic acid and quercetin (GA+Qu) on the process of jump in mitochondrial permeability (JMP) and calcium homeostasis of brain mitochondria in 9,12 and 15 month-old rats is investigated. It has been found that GA+Qu increases the threshold of mitochondrial sensitivity to Са²⁺  induced jump in mitochondrial permeability in 15-month-old rats, without affecting the transmembrane potential of mitochondria. 

Ключевые слова: митохондрии, крысы различного возраста, пора скачка митохондриальной проницаемости, флавоноиды, глицирризиновая кислота.

Keywords: mitochondria; rats of various ages; time of the jump of mitochondrial permeability; flavonoids; glycyrrhizic acid.

Важным звеном нарушения митохондриальных функций при старении является снижение способности митохондрий регулировать гомеостаз кальция в клетке и устойчивость к процессу скачка митохондриальной проницаемости (СМП) [1]. Процесс СМП обусловлен открытием комплекса пор, что является ключевым этапом каскадов гибели клеток. Именно поэтому митохондрии, и особенно процесс СМП, являются крайне перспективной мишенью для поиска нейропротекторных препаратов. Существуют различные способы увеличения устойчивости митохондрий к СМП, одним из перспективных подходов является регуляция кальциевого гомеостаза митохондрий – модуляция процессов входа и выхода кальция, а также действие на кальциевую емкость митохондрий. Открытие поры для проницаемости митохондрий (mPTP) на внутренней мембране митохондрий приводит к набуханию этих органелл, разобщению окислительного фосфорилирования, снижению синтеза молекул АТФ, что крайне пагубно может сказаться на состоянии как отдельных клеток, так и целых тканей и органов, и в конечном итоге, организма в целом. Известно,что данная пора представляет собой мега-канал, состоящий из адениловой транслоказы, подвергшейся выраженным конформационным изменениям, которая взаимодействует с другими белками внутренней мембраны. Изучение механизмов открытия и регулирование открытия этих пор может иметь большое значение для поиска путей коррекции многих митохондриальных дисфункций, в том числе и связанных с возрастными изменениями [2].

Ранее нами было показано, что с увеличением возраста у крыс в митохондриях головного мозга наблюдается повышение перекисного окисления липидов (ПОЛ), снижение процессов окислительного фосфорилирования, активности ферментов дыхательной цепи, биосинтеза митохондриальных белков. Введение таким животным супрамолекулярного комплекса, состоящего из флавоноида кверцитин и глицирризиновой кислоты вызывало восстановление изученных показателей [3,4].

Целью настоящей работы являлось исследование влияния супрамолекулярного комплекса, состоящего из глицерризиновой кислоты и кверцитина на процесс СМП и кальциевый гомеостаз митохондрий головного мозга крыс различного возраста.

Материал и методы исследования

В работе использованы самцы 9, 12, 15 месячных крыс белых беспородных крыс. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования [5] в среде, содержащей 320 мМ сахарозы, 10 мМ трис-НСl и 0,5 мМ ЭДТА или 0.5 мМ ЭГТА, 0,2% БСА, рН 7,4. Количественное определение содержания белка проводили биуретовым методом [6]. Набухание митохондрий головного мозга крысы определяли по изменению светорассеяния суспензии митохондрий при длине волны 540 нм. Набухание измеряли с использованием спектрофотометра Cary 60 (Agilent Technologies) при 25°С с интенсивным перемешиванием [2] в среде инкубации, содержащей 10 мМ трис-НСl, 120 мМ КСl, 5 мМ глутамат, 1 мМ малат и 2,5 мМ КН₂РО₄. Инициаторами скачка митохондриальной проницаемости служили хлористый кальций или синтетический пептид β-амилоид 25-35 (Аβ).

Супрамолекулярный комплекс, состоящий из флаваноида кверцетина и глицирризиновой кислоты (ГК+Кв) синтезировали в Институте Биоорганической химии АНРУз. Опытным животным различного возраста комплекс вводили в дозе 30 мг/кг веса тела животного в течении 3х дней.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований было обнаружено, что чувствительность митохондриальных мембран к нагрузке Са²⁺ зависит от возраста животного: у 9- и 12-месячных крыс контролируемое набухание вызывается добавкой Са²⁺ в концентрации 40 мкМ, тогда как у 15 месячных животных набухание вызывается добавкой 20 мкМ Са²⁺, что свидетельствует, что с возрастом митохондрии становятся более чувствительными к воздействию ионов кальция. Са²⁺-стимулированное набухание на 95-98% блокировалось специфическим ингибитором mPTP циклосопорином А, что подтверждает существующее мнение о главной роли этой поры в процессе набухания митохондрий. Вполне вероятно, что изменение с возрастом чувствительности mPTP к нагрузке кальцием во многом определяет изменения чувствительности тканей, лежащие в основе клеточных повреждений во время старения (табл.1). Полученные результаты совпадают с данными других исследователей, показавших, что при старении повышается чувствительность митохондрий к активации mPTP, выражающаяся в снижении пороговой концентрации Са²⁺, которая инициирует открытие mPTP [2]. Нагрузка митохондрий кальцием, количество которого соответствовало пороговым концентрациям, вызывала ускорение в 4-5 раз набухания митохондрий у 12 месячных животных по сравнению с митохондриями взрослых крыс. При сравнении полупериодов максимального набухания митохондрий 9 и 12 месячных крыс, было обнаружено, что у зрелых крыс данный показатель снижен в 4-5,7 раза. Увеличение скорости Са²⁺-индуцированного набухания у более взрослых 15 месячных животных приводило к уменьшению времени полного набухания митохондрий – в 2 и 4 раза соответственно по сравнению с 9-месячными животными.

При введении экспериментальным животным супрамолекулярного комплекса ГК+Кв были получены следующие результаты (рис.1).

Таблица 1.

Изменения Са2+-индуцированного набухания энергизованных митохондрий (M±m;n=6)

Так, у 9-месячных крыс введение препарата приводило к сокращению времени полного набухания практически в 4 раза, при этом значительно менялась кинетика, о чем свидетельствует резкое, более чем в 6 раз, сокращение времени полумаксимального набухания. В группе контрольных 9 месячных животных набухание вызывалось в ответ на добавление 40мкМ Са²⁺, в то время как в группе животных, получавших ГК+Кв, добавление уже 20мкМ Са²⁺ вызывало набухание митохондрий. Таким образом, в данной возрастной группе введение комплекса ГК+Кв приводит к снижению резистентности митохондрий.

В группе 12-месячных контрольных животных минимальной концентрацией, вызывающей набухание, являлась 30 мкМ Са²⁺. При этом набухание происходило в 2 этапа. В контроле в ответ на добавку 30 мкМ Са²⁺ митохондрии полностью набухали в среднем за 3 минуты, в то время как в группе животных, получавших комплекс ГК+Кв, набухание начиналось в ответ уже на 20 мкМ Са²⁺ и значение этого показателя составляло 1,93 мин, т.е. в 2,4 раза меньше). Время полумаксимального набухания – показатель, позволяющий оценить кинетику процесса, в группе контрольных животных (в ответ на 30 мкМ Са²⁺) равнялось в среднем 3,4 минутам, а в группе животных, получавших комплекс этот показатель (в ответ на 20 мкМ Са²⁺) был меньше минуты и равнялся в среднем 0,96 – то есть полумаксимальное набухание под действием ГК+Кв происходило в 3,5 раза быстрее. Таким образом, исследуемый комплекс для животных возрастной группы 9 и 12 месяцев оказывал явное негативное воздействие.

Рисунок 1. Влияние супрамолекулярного комплекса на Са²⁺-индуцированное набухание энергизованных митохондрий в зависимости от возраста животных (n=6; M±n)

Иная картина наблюдалась в группе 15-месячных животных - в этом случае комплекс оказывал ярко выраженное стабилизирующее воздействие. В данной возрастной группе контролируемое набухание как в контрольной, так и в опытной группе, вызывалось добавлением 20 мкМ Са²⁺. Однако в группе животных, получавших комплекс ГК+Кв митохондрии набухали значительно медленнее и более продолжительное время: у опытных животных по сравнению с интактными, скорость набухания митохондрий была снижена практически в 4 раза, при этом как время полумаксимального, так и полного набухания было увеличено в 2,2 раза по сравнению с контрольными значениями, что указывает на то, что комплекс ГК+Кв проявляет свою активность не на начальных этапах возрастных изменений в митохондриях, а у более старых крыс. В случае использования 40 мкМ Са²⁺, комплекс вызывал резкое сокращение как времени полного набухания, так и времени полумаксимального набухания, что свидетельствует о критическом изменении кинетики данного процесса.

Из литературных данных известно, что причинами образования mPTP является рост концентрации катионов кальция в матриксе митохондрий. Такие факторы как окислительный стресс, старение, недостаток адениновых нуклеотидов, деполяризация митохондрий и рост концентрации фосфата снижают пороговую концентрацию Ca²⁺, достаточную для индукции СМП. Открытие mPTP приводит к быстрому переносу протонов внутрь митохондрий, что способствует деполяризации внутренней митохондриальной мембраны и разобщению окислительного фосфорилирования. При этом вода с растворенными в ней низкомолекулярными соединениями устремляется внутрь митохондрий, что вызывает их набухание и повреждение внешней митохондриальной мембраны [7]. Предотвращение образования mPTP является перспективным подходом при поиске новых лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний, болезней сердца и метаболических заболеваний [8].

Ранее нами было показано, что  супрамолекулярный комплекс ГК+Кв способен модулировать функции митохондрий. На изолированных митохондриях печени крыс было показано, что комплекс в концентрации снижает перекисное окисление липидов митохондрий печени и головного мозга старых крыс [3,4]. Митохондриально-направленное действие этого комплекса было подтверждено и в работах, проведенных в условиях in vivo. В настоящем исследовании установлено, что ГК+Кв увеличивает порог чувствительности митохондрий к Са^2+- индуцированному скачку митохондриальной проницаемости 15 месячных крыс, не оказывая влияния на трансмембранный потенциал митохондрий, что служит основанием рекомендовать это соединение в качестве эффективного митопротектора.

Список литературы:

1. Kowaltowski A.J., Castilho R.F., Vercesi A.E. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress // FEBS Lett. 2001. Vol. 495, № 1-2. P. 12–15. 124.
2. Крестинина О.В., Круглов А.Г., Грачев Д.Е., Бабурина Ю.Л., Евтодиенко Ю.В., Мошков Д.А., Санталова И.М., Азарашвили Т.С. Возраст-зависимые изменения функций митохондрий при Са2+-индуцируемом открытии поры // Биологические мембраны, 2010. Т. 27. № 2. С. 178-183.
3. S. Dalimova, Sh.Kuziev, G.Umarova, G.Mukhammadjonova, M.Yunusova, N.Khamdamova, F.Eshboev. Influence of the supramolecular complex of glycyrrhizic acid with quercetin on age-related functional changes in rat brain mitochondria. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology 21(45&46):63-73; Y. 2020
4. Далимова С.Н., Далимов Д.Н., Умарова Г.Б., Мухамаджанова Г.М., Абдуллаева У.А. Скрининг антиоксидантной активности супромолекулярных комплексов, созданных на основе природых соединений. Теоретической и клинической медицины №3. Г. 2017  ISSN 2091-5853 Индекс 921. С 14-17
5. Gornal A.G. Bardawill C.J., David M. Determination of serum protein by means of biuret reaction.// J.Biol. Chem., 1949. V. 177. P. 751-766.
6. Sims NR. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J Neurochem.// 1990.-V.55(2).-P.698-707
7. Halestrap A.P., McStay G.P., Clarke S.J. The permeability transition pore complex: another view // Biochimie. 2002. Vol. 84, № 2-3. P. 153–166. 114. Elrod J.W., Molkentin J.D. 
8. Davis R., Williams M. Mitochondrial function and dysfunction: an update // J. Pharmacol. Exp.2012. Vol. 342, № 3. P. 598–607.