Биоразведка бактерий-продуцентов экзополисахаридов из различных природных экосистем для синтеза биополимеров из барды

АННОТАЦИЯ

Экзополисахариды (ЭПС) принадлежат к семейству органических загустителей или альтернативных гидроколлоидов микробного происхождения. Поскольку химическая структура обеспечивает полезные биоактивные функции, биосовместимость и способность к биоразложению, EPS используются в химической, пищевой, фармацевтической, косметической и упаковочной промышленности, а также в сельском хозяйстве и медицине. В этом исследовании были отобраны новые бактериальные штаммы на основе их способности синтезировать EPS из субстрата, содержащего барду в качестве источника питательных веществ, для определения лучшего кандидата для производства полимеров на биологической основе.

ABSTRACT

Exopolysaccharides (EPS) belong to the family of organic thickeners or alternative hydrocolloids of microbial origin. Because its chemical structure provides beneficial bioactive functions, biocompatibility, and biodegradability, EPS is used in the chemical, food, pharmaceutical, cosmetic and packaging industries, as well as in agriculture and medicine. In this study, new bacterial strains were selected based on their ability to synthesize EPS from a substrate containing vinasse as a nutrient source to determine the best candidate for the production of bio-based polymers.

Ключевые слова: среда, штамм, Azotobacter, Экзополисахариды, альгината, инокулирование, углеводы, Leuconostoc и Lactobacillus

Keyword: аmong, strain, Azotobacter, exopolysaccharides, alginate, inoculated, carbohydrates, Leuconostoc and Lactobacillus

Полученные результаты

Среди 99 недавно идентифицированных бактериальных штаммов, выделенных из различных природных экосистем, штамм Azotobacter chroococcum 76A был выбран как лучший производитель биополимеров, поскольку он синтезировал самую высокую концентрацию ЭПС во всех средах, содержащих барду. Максимальная концентрация ЭПС (44,6 ± 0,63 мг / 50 мл) наблюдалась через 24 ч, что соответствует его субстационарной фазе роста (7 × 108 ± 0,29 КОЕ / мл). Химическая характеристика полученного EPS показала, что основным компонентом являются углеводы, за которыми следуют уроновые кислоты и белки. Интересно, что сравнение ИК-спектра ЭПС с альгинатом методом FTIR-ATR выявило перекрытие пика, идентифицированного как гулуроновая кислота, компонент альгината.

Выводы

Потенциальная биотехнологическая способность A. chroococcum 76A синтезировать биополимер из барды, недорогих исходных материалов, представляет собой возможную альтернативу дорогостоящей утилизации сельскохозяйственных и пищевых отходов путем их преобразования в продукты с высокой добавленной стоимостью.

Экзополисахариды (ЭПС) полезны для широкого спектра промышленных применений. Они являются возобновляемыми источниками гидроколлоидов, которые используются в пищевой, фармацевтической, сельскохозяйственной, косметической и медицинской промышленности, а также в химической промышленности, где они заменяют полимеры на нефтяной основе [1,2,3,4].

ЭПС производятся бактериями, водорослями и, в меньших количествах, дрожжами и плесенью [5,6,7] для защиты клетки от неблагоприятных, ограничивающих или токсичных условий [8], тем самым улучшая конкуренцию между микробами в различных средах [9]. Известно, что большое количество микробных ЭПС синтезируется различными видами микробов, такими как декстран, вызываемый Leuconostoc и Lactobacillus, геллан, вызываемый Sphingomonas и Aureomonas, ксантан, вызываемый Xanthomonas, альгинаты, вызываемые Pseudomonas и Azotobacter, сукциногликан, вызываемый Alcalonicobaccidium и Rhialonicobacterium. , шизофиллан от Schizophylum, леван от Alcaligenes и Zymomonas, пуллулан от Aureobasidium, целлюлоза от Acetobacter, хитозан от Mucorales, галактоглюкополисахариды и биосурфактант от Achromobacter, Agrobacterium, Zhaizanleigen, Scaudomonasleigen, Scaudomonasleigen, 9, Scaizanleigen, Scaudomonas. В связи с большим разнообразием структур и функциональных свойств растет интерес к ЭПС, синтезируемым микроорганизмами. Фактически, микробный EPS может представлять собой хорошую альтернативу EPS, полученному из растений, животных и морских водорослей, поскольку они могут производиться в контролируемых условиях. Однако бактериальный EPS составляет лишь небольшую часть текущего рынка биополимеров из-за их высокой стоимости производства, которая в основном связана со стоимостью субстрата и восстановлением. Следовательно, использование более дешевых субстратов, таких как побочные продукты сельского хозяйства и отходы, может представлять собой хороший подход к снижению производственных затрат на биосинтез EPS.

В настоящее время управление и утилизация барды, стойких отходов сахарно-этанольной промышленности, стала приоритетом с точки зрения окружающей среды из-за ее загрязняющей нагрузки, особенно биологической потребности в кислороде (БПК). Пищевые сельскохозяйственные отходы являются дополнительным дешевым, устойчивым и привлекательным субстратом для производства биополимеров или других продуктов с высокой добавленной стоимостью. Во многих исследованиях оценивалась переработка и потенциальное использование сельскохозяйственных и пищевых отходов и побочных продуктов или специальных энергетических культур для производства полигидроксиалканоата (РНА), янтарной кислоты, биотоплива и биогаза, а также биологический водород и летучие жирные кислоты. Природная среда представляет собой важный источник микробных штаммов, которые проявляют интересную ферментативную активность для биотехнологических применений.

Целью этого исследования был отбор бактериальных штаммов на основе их способности синтезировать EPS из субстрата, содержащего барду в качестве источника питательных веществ, и определение наилучшего кандидата для производства полимеров на биологической основе.

Методы

Состав барды сахарного тростника

Химический состав барды сахарного тростника определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (детектор показателя преломления 133; система Gilson; насос 307, колонка Metacarb 67 h, Varian, с потоком 0,4 мл / мин 0,01 н. H2SO4). Химическая потребность в кислороде (ХПК) оценивалась с помощью термореактора ECO08 (Velp Scientifica, Usmate, Monza Brianza, Италия) и фотометра PF-3 (Velp Scientifica) с использованием набора NANOCOLOR®. BOD5 измеряли с помощью BOD ​​Sensor System 6 (Velp Scientifica) в соответствии с инструкциями производителя.

Мониторинг роста микробов и производства EPS

Azotobacter chroococcum 76A инокулировали в 50 мл жидкого субстрата, состоящего из барды (1%) и сахарозы (5%) в качестве источников углерода. Образцы отбирали сразу после инокуляции и через 8, 16, 24, 32 и 48 часов инкубации при 30 ° C для определения роста бактерий и концентрации EPS, как описано выше.

Химическая характеристика EPS

После стандартизации посевного материала A. chroococcum 76A инокулировали в жидкую или твердую среду, содержащую барду (1%) и сахарозу (5%).

Рисунок №1: Сбор ЭПС, произведенного Azotobacter chroococcum 76A, из твердой среды, содержащей барду (1%) и сахарозу (5%), через 24 часа инкубации при 30 ° C.

Через 24 ч при 30 ° C EPS извлекали из жидких культур, как описано выше, или брали непосредственно с планшетов путем многократной промывки дистиллированной водой до исчезновения видимого липкого налета, после чего EPS собирали в стерильные соколиные пробирки. EPS, полученные из жидкой или твердой среды, осаждали этанолом, лиофилизировали, а затем растворяли в горячей воде, охлаждали при комнатной температуре и, наконец, подвергали диализу против воды в течение 3 дней (Visking Dialysis Membrane MWCO 12–14 кДа, GmbH, Германия).

Затем образцы EPS снова подвергали сублимационной сушке. Общий химический состав определяли путем анализа содержания общих углеводов, белков и уроновых кислот. Общее содержание углеводов определяли количественно фенол-сернокислотным методом с использованием стандартной кривой с глюкозой. Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка Bradford (BioRad, Милан, Италия) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта. Общее содержание уроновых кислот определяли по методу, описанному Блюменкранцем и Ашоу-Хансеном, с использованием галактуроновой кислоты для калибровки.

Таблица 1.

Процент бактериальных штаммов, способных расти и секретировать EPS на твердой среде, содержащей смесь различных концентраций маннита (1%) или сахарозы (5%) в качестве источников углерода

Моносахаридный состав ЭПС определяли после кислотного гидролиза 2 н. Трифторуксусной кислотой (ТФУ) при 120 ° C в течение 2 ч с использованием ферментативного анализа глюкозы. Спектральную характеристику проводили с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье с ослабленным полным отражением (FTIR-ATR) и с помощью 1H-ЯМР. Инфракрасные спектры EPS регистрировали при комнатной температуре с помощью спектрометра Spectrum 100 FTIR (Perkin-Elmer Inc., Norwalk, CT, USA), снабженного универсальным устройством для отбора проб НПВО с кристаллами алмаза. Для анализа 1H-ЯМР образцы растворяли в D2O (5 мг / мл) и спектры записывали на 1H-ЯМР Bruker AMX-600 МГц при 40 ° C [45].

Список литературы:

1. Ahmad NH, Mustafa S, Che Man YB. Microbial polysaccharides and their modification approaches: a review. Int J Food Prop. 2015;18:332–47.
2. Llamas I, Amjres H, Mata JA, Quesada E, Béjar V. The potential biotechnological applications of the exopolysaccharide produced by the halophilic bacterium Halomonas almeriensis. Molecules. 2012; 17:7103–20.
3. Mata JA, Béjar V, Llamas I, Arias S, Bressollier P, Tallon R. Exopolysaccharides produced by the recently described halophilic bacteria Halomonas ventosae and Halomonas anticariensis. Res Microbiol. 2006; 157:827–35.
4. Rühmann B, Schmid J, Sieber V. High throughput exopolysaccharide screening platform: from strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohyd Polym. 2015; 122:212–20.
5. Crescenzi V. Microbiol polysaccharides of applied interest. Ongoing research activities in Europe. Biotech Prog. 1995; 11:251–9.
6. Sutherland IW. Biotechnology of microbial exopolysaccharides. Cambridge: Cambridge University Press; 1990.
7. Sutherland IW. Novel and established applications of microbial polysaccharides. Trends Biotechnol. 1998;16:41–6.
8. Ventorino V, Sannino F, Piccolo A, Cafaro V, Carotenuto R, Pepe O. Methylobacterium populi VP2: plant growth-promoting bacterium isolated from a highly polluted environment for polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) biodegradation. Sci World J. 2014; 2014:931793.
9. Kumar AS, Mody K. Microbial exopolysaccharides: variety and potential applications. In: Rehm BHA, editor. Microbial production biopolymers and polymer precursors—application and perspectives. Norfolk: Caister Academic Press; 2009. p. 229–53.