Вазорелаксантное действие алкалоидов копсинин и N4-йод метилат копсинина в зависимости от химической структуры

АННОТАЦИЯ

В работе исследовано вазорелаксантное действие алкалоидов копсина и его производного N4-йодметилат копсина в зависимости от их химической структуры, выделенные из растения Vinca erecta на  гладких мышцах препарата  аорты крыс в изометрических условиях. Полученные результаты показали, что вазорелаксантное действие копсина и N4-йодметилат копсина зависит от их концентрации и химической структуры и связано с блокадой Сa²⁺L-канала, расположенного в плазмолемме гладкомышечных клеток сосудов.

ABSTRACT

The work investigated the vasorelaxant effect of copsin alkaloids and its derivative N4-iodomethylate copsin, depending on their chemical structure, isolated from the Vinca erecta plant on the smooth muscles of a rat aorta preparation under isometric conditions. The results obtained showed that the vasorelaxant effect of copsin and N4-iodomethylate of copsin depends on their concentration and chemical structure and is associated with the blockade of the Ca2 + L-channel located in the plasmolemma of vascular smooth muscle cells.

Ключевые слова: алкалоид, копсинин, N4-йодметилат копсинин, сосуды, гладкие мышцы, Сa²⁺L-канал, адренорецептор, релаксант.

Keywords: alkaloid, copsinin, N4-iodomethylate copsinin, vessels, smooth muscles, Ca2 + L-channel, adrenergic receptor, relaxant.

Введение

На сегодняшний день описано более 400 алкалоидов растительного происхождения. Классификация, синтез/биотрансформация и широкий спектр фармакологической активности алкалоидов были подробно изучены многими исследователями, и установлено, что одним из потенциальных источников алкалоидов является вид растений Vinca erecta [1]. Vinca erecta - это в основном горные виды и представляют собой двулетние или многолетние травянистые растения. В народной медицине растение вида Vinca erecta используется как понижающее температуру тела, болеутоляющее, а также при лечении гастрита, тонзиллита, противовоспалительное, понижающее артериальное давление, заболевания печени, малярию, как стимулирующее средство [2].

Целью данного исследования было проанализировать вазорелаксантное действие алкалоидов копсина и его производного N4-йодметилат копсина, выделенного из растений вида Vinca erecta, на изометрическую сократительную активность гладких мышц аорты крысы (рис. 1).

Рисунок 1. Структурная формула алкалоидов копсина (A) и N4-йодметилат копсина (B) [1]

Материалы и методы. Приготовление препарата аорты проводилось по стандартной методике.

Эксперименты проводились на здоровых белых песпородистых крысах (150–200 гр.), которых содержали в стандартных условиях корма и воды. После анестезии животных хирургически изолировали и разрезали на кольцевые сегменты (l = 2–4 мм; ø = 1–2 мм) препарат аорты. В экспериментах использовался физиологический раствор Кребса-Ксензелеита следующего химического состава (в мМ): (мМ): NaCl - 120,4; КСл - 5; NaHCO₃ - 15,5; NaH₂PO₄ - 1,2; MgCl₂ - 1,2; СaСl₂ - 2,5; С₆Н₁₂O₆ - 11,5 (rN = 7,4) [3]. Солевой раствор аэрировали карбогеном (O₂–95% и СO₂–5%), а постоянную температуры (t = + 37 ± 0,5 ° C) поддерживали с помощью ультратермостата (U-8; Болгария). Сократительную активность аортального сосудистого препарата регистрировали в изометрических условиях с помощью датчика мощности FT-03 (Grass Instrument Co., США), устройства усиления сигнала (Grass Instrument, США) на Endym 621.02 (Чехия) стандартным методом (механография).

В экспериментах использовали реагенты гидрохлорид верапамила [4,5] (Sigma-Aldrich, Германия), NaHCO₃, CaCl₂, MgSO₄, глюкоза, NaCl, KSl, NaH₂PO₄ (Россия). Влияние исследуемых алкалоидов на Ca²⁺L-канал оценивали по амплитуде силы сокращения, создаваемой с помощью KCl (50 мМ) [6,3]. Влияние алкалоидов, изученных в экспериментах, на активность резервного Ca²⁺-канала (SOCC) / рецепторзависимых Ca²⁺–каналов (ROCC - рецептор - оперативные Ca²⁺–каналы) оценивалась согласно [7]. Результаты, полученные был статистически обработан с использованием специального программного пакета OriginPro c. 8.5 SR1 (EULA, Northampton, MA 01060–4401, США) [8]. Результаты представлены в виде M ± m результатов экспериментов, выполненных при n повторениях, где M - среднее арифметическое, а m - значение стандартной ошибки. Также результаты эксперимента рассчитывались на основе t-критерия Стьюдента уровня статистической достоверности значений между группами и оценивались как статистически достоверные при значениях << 0,05, r <0,01.

Первоначально препарат аорты крысы инкубировали при напряжении 1 г (9,8 ~ 10 мН) в течение ~ 45-60 мин до регистрации нормальной электромеханической активности. На следующем рисунке показана блок-схема экспериментального устройства, предназначенного для регистрации сократительной активности препаратов для аорты крысы (рисунок 2).

Рисунок 2. Общая схема устройства для регистрации сократительной активности гладких мышц сосудов аорты крысы в изометрических условиях [9]

В данном случае А - это испытательный прибор, в специальный контейнер объемом 5 мл (1) помещается физиологический раствор (2), а постоянная температуры физиологического раствора обеспечивается с помощью термостата (3). Также раствор оборудованный смесью газов, содержащей 5% - CO₂ и 95% -O₂; (5), устройство для измерения механической активности (4) подключено к устройству Endim 621.02 (7) через усилитель сигнала (6). V - это отдельный препарат гладких мышц аорты (8), прикрепленный к неподвижному крючку (9), а другой - к крючку механотрона (10).

Pезультаты и их обсуждение. Эксперименты показали, что алкалоиды копсин (50–300 мкМ) и N4-йодметилат копсин (5–30 мкМ) оказывают значительное вазорелаксантное действие на изометрическую сократительную активность (in vitro) препарата аорты крысы за счет KСl (50 мМ). В частности, было обнаружено, что копсин снижает силу сокращения при концентрации 50 мкМ на 6,1 ± 3,1% по сравнению с контролем и при максимальной концентрации 300 мкМ на 62,2 ± 4,9% (n = 4–6). Также было обнаружено, что N4-метилат йода снижает силу сокращения на 34,5 ± 4,7% при концентрации 5 мкМ по сравнению с контролем и на 83,2 ± 3,2% при максимальной концентрации 30 мкМ. Значения копсина и N4-йодметилат копсина (EС₅₀) составили 178,8 мкМ и 8,7 мкМ, соответственно (рис. 3 A и B).

Рисунок 3. Зависимые от концентрации вазорелаксантное действие алкалоидов копсина (A) и N4-йодметилат копсина (B) на препарате аорты с использованием KСl (50 мМ).

 По оси ординат сила сокращения аорты принятая за 100% силы сокращения, вызванной 50 мМ KСl. По оси абсцисс - концентрация алкалоидов в мкМ. Индекс достоверности во всех случаях (* - r<0,05; ** r<0,01; n = 4–6).

В экспериментах оценивалось участие потенциал-зависимых Sa2 + -каналов L-типа в обеспечении расслабляющего эффекта алкалоидов копсина и N4-йодметилат копсина, а также изучалось их влияние на восстановление препаратов аорты, вызванное кумулятивным добавлением СaCl₂ в бескальциевую среду с 50 мМ KCl. В этих экспериментах увеличение концентрации СaCl₂ (0–2,5 мМ) в среде инкубации привело к постепенному увеличению силы сокращения аорты в результате введения ионов Сa²⁺ через Сa²⁺ -каналы L-типа (рис. 4 A). Присутствие алкалоидов, изученных в среде инкубации, значительно снижает развитие сил сокращения в ответ на увеличение СaCl₂ (рис. 4 A). Эти результаты предполагают, что релаксантный эффект исследуемых алкалоидов может быть связан с уменьшением количества [Сa²⁺]_i на входе Ca²⁺-каналов L-типа и снижением активности этого сокращения.

Чтобы дополнительно прояснить участие Ca²⁺-каналов L-типа в обеспечении расслабляющего действия алкалоидов копсина и N4-йодметилат копсина, их действие было изучено в присутствии верапамила, специфического блокатора этого канала. В этом эксперименте было замечено, что в присутствии верапамила EС₅₀ = 0,1 мкМ их релаксантный эффект снижался. В этом случае сила восстановления копсина (EC₅₀ = 178,8 мкМ) и N4-йодметилата (EC₅₀ = 8,7 мкМ) была дополнительно увеличена до 4,6 ± 3,4% (54,6 ± 4,2% по сравнению с контролем). ) и ослабление до 8,3 ± 3,1% (58,3 ± 4,8% относительно контроля) (рис. 4 В).

Рисунок 4. Релаксантный эффект алкалоидов копсина и N4-йодметилат копсина зависит от концентрации [Ca²⁺] и состояния потенциально-зависимых Ca²⁺ -каналов L-типа. Влияние копсинина и N4-йодметилатного копсина на сокращение аорты крысы, вызванное кумулятивным добавлением CaCl2 к растворам A-Krebs.

 По оси ординат сила сокращения аорты принимается равной 100% силы сокращения, вызываемой 50 мМ KSl. По оси абсцисс - концентрация SaCl2. Расслабляющий эффект копсина и N4-йодметилат копсина на сокращение мышц, вызванное 50 мМ KSl в присутствии B-верапамила (0,1 мкМ) (достоверность во всех случаях * - r<0,05; ** r<0,01; n = 4–6).

На основании полученных результатов можно сказать, что блокада L-Сa²⁺ -каналов лежит в основе релаксантного действия алкалоидов копсина и N4-йодметилат копсина. Однако, хотя верапамил может частично сохранять расслабляющий эффект алкалоидов, изученных в существующих условиях, могли быть активированы другие механизмы, включая блокаду L-Сa²⁺ -каналов и снижение транспорта ионов Сa²⁺ в гладкомышечных клетках.

Помимо потенциально зависимых Сa²⁺-каналов, Сa²⁺-каналы, контролируемые рецепторами, также играют важную роль в регуляции гомеостаза Сa²⁺ в гладкомышечных клетках [6]. Чтобы оценить влияние алкалоидов, изученных в последующих экспериментах на Сa²⁺-каналы, контролируемые рецепторами, сокращение мышц аорты, вызванное фенилэфрином (ФE), агонистом α1-адренорецепторов, в основном обеспечивается поступающими ионами Сa²⁺ через Сa²⁺-каналы, контролируемые рецепторами [10].

В наших экспериментах изучалось влияние алкалоидов на силу сокращения аорты, индуцированную ФЭ, в присутствии блокатора Сa²⁺-каналов L-типа - верапамила. В этих условиях сокращение мышц, вызванное ФЭ, было на 13,7 ± 2,8% ниже, чем при отсутствии верапамила. В этих условиях алкалоиды копсин (200 мкМ) и N4-йодметилат копсин (50 мкМ)

снижали сокращение аорты, вызванное ФE, максимум до 77,4 ± 5,1% и 60,2 ± 4,3%, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 5 A). и Б).

Рисунок 5. Влияние алкалоидов копсина (A) и N4-йодметилата копсина (B) на фенилэфрин-индуцированное сокращение аорты крысы

 Дозозависимые эффекты копсинина и N4-йодметилата копсинина на сокращение аорты крысы, вызванное 1 мкМ ФE. По оси ординат сила сокращения аорты получается как 100% от силы сокращения аорты, называемой с использованием 1 мкМ ФE. По оси абсцисс - концентрация алкалоидов. (индекс надежности во всех случаях * - r<0,05; ** r<0,01; n = 4–6).

В этих экспериментах значения EС₅₀ копсина и N4-йодметилат копсина составляли 68,1 мкМ и 33,5 мкМ соответственно. Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемый эффект исследуемых алкалоидов может быть предсказан путем блокады рецепторно-контролируемых Сa²⁺-каналов. Влияние исследуемых алкалоидов на Сa²⁺-каналы, контролируемые рецепторами, можно объяснить дополнительными экспериментами с блокатором α-адренорецепторов фентоламином (ФA). В наших экспериментах было обнаружено, что релаксантный эффект алкалоидов копсина (200 мкМ) и N4-йодметилат копсина (50 мкМ) снижает эффект ФE на 51,6 ± 5,3 и 45,4 ± 4,5 в присутствии 10 мкМ фентоламина (6- картина).

Рисунок 6. Влияние фентоламина (10 мкМ) на релаксантный эффект копсина алкалоидов и метилата N4-йода

По оси ординат - сила сокращения аорты была получена с использованием 100 мкМ ФE как 100% силы сокращения аорты. (индекс надежности во всех случаях * - r<0,05; ** r<0,01; n = 4–6).

Эти результаты предполагают, что релаксантный эффект исследованных алкалоидов может быть связан с блокадой Сa²⁺-каналов, контролируемой рецепторами.

Выводы. Алкалоиды - копсин и его производное N4-йодметилат копсин оказывает расслабляющее действие, эффективно снимает предварительно индуцированное сокращение аорты крысы с помощью гиперкальциемического раствора и фенилэфрина.

На основании анализа литературы и результатов экспериментов, сосудорасширяющее действие алкалоидов копсина и N4-йодметилат копсина, выделенных из растений вида Vinca erecta, на изометрическую сократительную активность лекарственного средства для сосудов аорты крысы in vitro может быть в основном связано с блокадой Сa²⁺-канала L-типа.

Продукт взаимодействия метилиодида (CH₃I) с копсином растительного происхождения приводит к значительному увеличению релаксантной активности копсина метилата N4-йода.

Научные/экспериментальные результаты, полученные в этом исследовании, могут быть использованы в качестве теоретической основы для разработки антигипертензивных фармакологических препаратов на основе дитерпеноидных алкалоидов.

Список литературы:

1. Adizov Sh.M.,Tashkhodzhaev., Pratik P., Upadhyay P.Kh., Yuldashev M., Mirzaeva M. Alkyl-and Acyl-Derivatives of Copsinine and Pseudocopsinine and Their Criystal Structures // Chemistry of Natural Compounds. – 2018. – V.54. – P.147-152.
2. Sadritdinov F.S., Kurmukov A.G. The Pharmacology of the Plant Alkaloids and Their Use in Medicine // Tashkent – 1980. – P.47.
3. Kim B., Jo C., Choi H.–Y., Lee K. Vasorelaxant and hypotensive effects of cheonwangbosimdan in SD and SHR rats // Hindawi Evidence–Based Complementary and Alternative Medicine. – 2018. – V.2018. – P.1–8.
4. Ozaki H., Ohyama T., Sato K., Karaki H. Ca²⁺–Dependent and independent mechanisms of sustained contraction in vascular smooth muscle of rat aorta // Japan J. Parmacol. – 1990. – V.52(510). – P.509–512.
5. Martinsen A., Baccelli C., Navarro I., Abad A., Quetin–Leclerc J., Morel N. Vascular activity of a natural diterpene isolated from Croton zambesicus and of a structurally similar synthetic trachylobane // Vascular Pharmacology. – 2010. – V.52. – P.63–69.
6. Cherkaoui–Tangi K., Israili Z.H., Lyoussi B. Vasorelaxant effect of essential oil isolated from Nigella sativa L. seeds in rat aorta: Proposed mechanism // Pak. J. Pharm. Sci. – 2016. – V.29(1). – P.1–8.
7. Hoe S.–Z., Lee C.–N., Mok S.–L., Kamaruddin M.Y., Lam S.–K. Gynura procumbens Merr. decreases blood pressure in rats by vasodilatation via inhibition of calcium channels // Clinics. – 2011. – V.66(1). – P.143–150.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия // Москва. – Изд – во «Высшая школа». – 1990. – С.23–284.
9. Vandier С., Le Guennec J.Y., Bedfer G. What are the signaling pathways used by norepinephrine to contract the artery? A demonstration using guinea pig aortic ring segments // Adv. Physiol. Educ. – 2002. – V.26. – P.195–203.
10. Karaki H., Ozaki H., Hori M. et al. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle // Pharmacological Reviews. – 1997. – V.49(2). – P.158–229.