Изменения активности НАД.Н оксидазы и выхода цитохрома C из внутренней мембраны митохондрий при автоокислении и перекисном окислении липидов при ишемии

АННОТАЦИЯ

В данной статье описан эксперимент, который был проведен в митохондриях, выделенных из печени крысы, инкубированных в  условиях ишемии при 36,7 ° C (аутоокисление). В результате образовывался малоновый диальдегид, и этот процесс ускорялся по мере продолжения эксперимента. Образование малонового диальдегида резко ускоряется в процессе инкубации при добавлении в митохондрии активатора перекисного окисления.

ABSTRACT

In this article, an experiment was carried out in mitochondria isolated from rat liver, incubated under ischemic conditions at 36.7°C (autooxidation), malondial-dehyde was formed, and this process accelerated as the experiment continued. The formation of malondialdehyde is sharply accelerated during incubation when a peroxidation activator is added to the mitochondria.

Ключевые слова: митохондрия, печень, крыс, ишемия, аутоокисление, малоновый диальдегид.

Keywords: mitochondria, liver, rats, ischemia, autooxidation, malondialdehyde.

После получения результатов исследований о важной роли цитохрома с в процессах апоптоза и некроза интерес к изучению данной проблемы возрастает [1, 2]. По мнению некоторых исследователей, одним из факторов, вызывающих апоптоз, является выброс цитохрома с и других индукторов из внутренней мембраны в результате разрыва внешней мембраны из-за чрезмерного набухания митохондрий [3, 4, 5]. Однако в других исследованиях [6] указывается на то, что выход цитохрома с осуществляется также из интактных митохондрий. Деструкция митохондрий приводит к высвобождению цитохрома с из внутренней мембраны через митохондриальные «поры», что приводит к разрушению клеток [7, 8]. Цитохром с сигнализирует о начале апоптоза, который часто сопровождается появлением различных патологических состояний.

Мишенью для активной формы кислорода является повреждение участка ДНК митохондрий [9, 10]. Повреждение митохондриальной ДНК [11] инициирует «митохондриальные заболевания».

Однако до настоящего времени не проводился сравнительный анализ активности НАДH – оксидаз в изолированных митохондриях, которые были инкубированы с добавлением или без добавления активатора перекисного окисления липидов в условиях ишемии.

Цель исследования. В процессе инкубации митохондрий, выделенных из печени при базальной температуре (36,7ºС) исследовать изменения липидного обмена в условиях аутоокисления и перекисного окисления липидов.

Материалы и методы исследования. Митохондрии из печени крыс были выделены при помощи дифференциального центрифугирования [12] с некоторыми модификациями [13] с использованием 0,25 М сахарозы, 10 мМ трис-HCl – буфера, pH 7,4, 2 мМ ЭДТА. Затем изолированные митохондрии дважды промывали и очищали в среде для выделения без ЭДТА. Изолированные митохондрии были разделены на две группы: первая группа – в качестве контроля, а к митохондриям второй группы добавили активатор перекисного окисления липидов.

Затем митохондрии инкубировали при 36,7ºС при постоянном перемешивании в течение 15 мин. Результаты, полученные до инкубации и во время инкубационного периода, сравнивали и анализировали.

Аскорбат – зависимую скорость перекисного окисления липидов определяли микрометодом, предложенным Ю.А. Владимировым и А.И. Арчаковым по тиобарбитуратовой кислоте [14].

Интактные митохондрии дают возможность изучить, прежде всего, интенсивность процесса дыхания и окислительного фосфорилирования, которая в той или иной степени зависит от активности ферментов дыхательной цепи митохондрий. Однако интактные митохондрии не позволяют судить о полной активности этих ферментов, так как это связано с тем, что с одной стороны существует система окислительного фосфорилирования митохондрий, с другой – ограниченный доступ окисляющих субстратов к активному центру ферментов.

Учитывая это мы использовали единожды, замороженные-и размороженные митохондрии для изучения активности митохондриальных оксидаз [15]. Влияние флавоноидов на активность оксидазных систем дыхательной цепи митохондрий определяли полярографическим методом. Известно, что митохондрии печени имеют две системы окисления – внутренний путь фосфорилирования при окислении субстратов и сукцината НАД и внешний путь свободного окисления при добавлении НАДН. Начальным звеном дыхательной цепи этого пути является НАДН₂ – цитохром B₅ – редуктаза.

Один из этих путей окисления (внутренний путь) тормозится ротеноном. Среда измерения: pH 7,4, 0,05 – M трис – HCl, 0,005 M гистидин и 0,66 M сахароза.

Активность ротенон – чувствительной НАДН – оксидазы была определена в объеме 1 мл ячейки в 3 мкМ НАДН₂. Активность НАДН – оксидазы также определялась в присутствии 2 мкг ротенона. По активности суммарной НАД.Н – оксидазы рассчитывалась активность НАД.Н оксидаз, которые воспринимают и не воспринимают ротенон [15]. Активность оксидаз выражали в нанограммах атома кислорода, потребленного за 1 минуту из расчета 1 мг митохондриального белка при 25ºС. Реакцию инициировали добавлением митохондрий к среде измерения в клетке. Количество белка в митохондриях определяли по методу Lowry et al. [16].

Результаты и их обсуждение. Результаты по изучению влияния аутоокисления и перекисного окисления липидов на малоновый диальдегид в митохондриях в условиях ишемии представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Изменение образования малонового диальдегида в митохондриях при аутоокислении и перекисном окислении липидов при ишемии (M ± m, n = 10-12)

Примечание. Различия в надежности здесь и в других таблицах: * R <0,05; ** R <0,02; *** R <0,01; **** R <0,001. АО – автоокисление, ПОЛ – перекисное окисление липидов. Перекисное окисление липидов в митохондриях измеряли, добавляя 20 мкМ FeS0₄ + 0,2 аскорбата. Накопление малонового диальдегида измеряли при оптической плотности 532 нм, KС1 – 115 мМ, NaH₂PO₄ – 1 мМ, трис-НС1 – 5 мМ (pH 7,4) в среде измерения и температуре 36,7 °C.

Если при инкубации аутоокисленных митохондрий в течение 3 и 6 мин не наблюдалось изменений в образовании малонового диальдегида, то в течении 9 и 15 мин этот показатель увеличивался на 12,0 и 15% соответственно. При измерении путем добавления активатора перекисного окисления липидов в митохондриях количество малонового диальдегида через 3 и 6 минут увеличивалось на 29,9 и 42,0% соответственно. Продолжение эксперимента значительно ускорило увеличение количества малонового диальдегида Если за 9 минут этот показатель увеличился на 66,4%, то за 15 минут увеличился на 83,3%.

Таким образом, при ишемии, перекисное окисление липидов в митохондриях происходит за счет аутоокисления и находится в прямой зависимости от продолжительности ишемии, однако при добавлении активатора перекисного окисления липидов этот процесс резко усиливается.

Митохондрии печени имеют две системы системного окисления – субстраты, которые фосфорилируются и окисляются сукцинатом и НАД во внутренней дыхательной цепи, а после добавления НАД происходит внешнее свободное окисление, которое проходит через НАДН₂ – цитохром В₅ – редуктазу [17] (рис.1). Внутренний путь в дыхательной цепи ингибируется ротеноном. Внешний путь окисления НАД чувствителен к цитохромоксидазой флавин – 5 – цитохром В₅ только тогда, когда цитохром с, расположенный на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, выходит из мембраны в мембранное пространство, и ротенон не оказывает влияния на этот путь.

Рисунок 1 – Дыхательная цепь (митохондрии) и антиоксидантные системы митохондрий

1 – окисление НАД.Н CoQ под действием фермента НАД.Н – CoQ-редуктазы и одновременное образование супероксида (O₂); 2 – окисление восстановленного цитохрома с, катализируемое KoQH₂ – цитохром s – редуктазой, и одновременное образование супероксида (O₂) из O₂; 3 – окисление восстановленного цитохрома с кислородом под действием цитохромоксидазы; 4 – повторное окисление супероксида (O₂) до O₂ за счет утечки цитохрома между митохондриальными мембранами; 5 – превращение O₂ в N₂O₂ катализом супероксиддисмутазы; 6 – превращение Н₂О₂ в Н₂О и в О₂ под действием каталазы; 7 – превращение восстановленного глутатиона до окисленного глутатиона под действием глутатионпероксидазы при участии Н₂О₂ [17].

Результаты, полученные по изучению высвобождения цитохрома с из внутренней мембраны митохондрий при аутоокислении и перекисном окислении липидов при ишемии представлены в таблице 2.

Если окисление ротенон-чувствительной НАД.Н – оксидазы (внутреннее дыхание) увеличивалось на 7,9% и 29,5% соответственно при инкубации митохондрий в условиях аутоокисления в течение 3 и 6 мин, и было равно контрольному значению, то через 9 мин и 15 мин этот показатель снизился на 31,1% по сравнению с контролем. Активность ротенон нечувствительной НАД.Н – оксидазы (внешнее дыхание), напротив, практически не изменяется спустя 3 минуты инкубации, а затем постепенно увеличивается. Если инкубация на 6 минуте увеличивается на 18,4%, то 9 и 15 минут она увеличивается на 35,5 и 43,0% соответственно. Активность ротенон-чувствительной НАД.Н– оксидазы увеличивается на 26,5% через 3 мин при инкубации с добавлением активатора липидов, через 6 мин по сравнению с предыдущим временем, увеличивалась на 14,8% относительно контроля. Напротив, на 9-й минуте эксперимента этот показатель снизился на 12,1% по сравнению с контролем, а на 15-й минуте – на 56,6%. При инкубации с добавлением к митохондриям активатора перекисного окисления липидов активность НАД.Н – оксидазы, нечувствительной к ротенону, начинала увеличиваться с начала инкубации и соответственно ускорялась по мере продолжения эксперимента. Если на 3-й минуте эксперимента она увеличилась на 18,9%, то на 6, 9 и 15 минутах – на 32,8; 52,9 и 68,7% соответственно.

Таблица 2.

Изменения активности ротенон-чувствительной и ротенон – нечувствительной НАД.Н– оксидаз при аутоокислении и перекисном окислении липидов при ишемии (M ± m; n = 10-12)

Рисунок 2.

Открытие «пор» (дыр) во внутренней мембране митохондрий под действием активной формы кислорода (АКФ) приводит к набуханию митохондриального матрикса, разрыву внешней мембраны митохондрий, выходу цитохрома с и других проапоптических белков через мембрану. Синие точки – это низкомолекулярные вещества в пространстве между мембранами, когда матрикс и поры закрыты [17].

Таким образом, при инкубации митохондрий при ишемии (автоокисление), активность ротенон-чувствительной НАД.Н – оксидазы начинает медленно увеличиваться через 3 минуты эксперимента, достигая максимального значения к 6 минуте, а спустя 9 минут приближается к контрольным показателям и, снижается через 15 минут, в то время как активность ротенон – нечувствительной НАД.Н – оксидазы наоборот, начинает медленно увеличиваться, и этот процесс ускоряется по мере продолжения эксперимента.

При инкубации с добавлением активатора перекисного окисления липидов митохондрий пик активности НАД.Н – оксидазы достигается в течение 3 минут, а затем постепенно начинает уменьшаться. В то же время активность ротенон-нечувствительной НАД.Н – оксидазы, увеличивается с начала инкубации и соответственно ускоряется по мере продолжения эксперимента. Анализируя полученные результаты, можно заключить, что выброс цитохрома с из внутренней мембраны митохондрий в интерстициальное пространство при аутоокислении в условиях ишемии сначала практически не наблюдается, но при продолжении инкубации этот процесс начинает усиливаться, значит этот процесс значительно усиливается при инкубации с добавлением активатора перекисного окисления.

Выводы:

1. Когда митохондрии, выделенные из печени крыс, инкубировали в условиях ишемии при 36,7°C (аутоокисление), образовывался малоновый диальдегид, и этот процесс ускорялся по мере продолжения эксперимента. Образование малонового диальдегида резко ускоряется при инкубации при добавлении в митохондрии активатора перекисного окисления.

2. При аутоокислении активность ротенон чувствительной НАД.Н– оксидазы в митохондриях снижается, активность ротенон – нечувствительной НАД.Н– оксидазы увеличивается за счет высвобождения цитохрома с из внутренней мембраны, а при перекисном окислении липидов эти изменения ускоряются.

3. При различных стрессовых состояниях и патологиях высвобождение цитохрома с из внутренних мембран митохондрий клеток организма аналогично высвобождению цитохрома с при ишемии в изолированных митохондриях.

Список литературы:

1. Бодрова М.Э., Дедухова В.И., Мохова Е.Н. Генерация трансмембранного элекрического потенциала при окислении НАД.Н по внешнему пути и разобщающее действие жирных кислот после кратковременного открытия Са²⁺ – зависимой циклоспорин А – чувствительной поры в митохондриях печени. // Биохимия, 2000. – Т.65. – вып.4. – С.562-569.
2. Галитовский В.Е., Гогвадзе В.Г. Исследование Са²⁺ аккумулирующей способности митохондрий тимоцитов при апоптозе. //Биохимия, – 2001, – Т.66, - вып.6, С.775-779.
3. Фильченков А.А., Абраменко И.В. Апоптоз в патогенезе заболеваний человека. – Киев: ДНА, 2001. – 120 c.
4. Фильченков А.А., Залесский В.Н. Апоптоз кортикальных нейронов при развитии ишемических инсультов // Нейрофизиология. – 2002. – Т. 34, №6. – С. 468-484.
5. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунов Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. – 2000. – Т. 65, Вып. 8. – С. 1029-1046.
6. Skulachev V. P. Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Letters, 1998. – Vol. 423. – №3, – Pp. 275-280.
7. Yang J., Liu X., Bhalla K., Kim C. N., Ibrado A. M., Cai J., et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: Release of cytochrome c from mitochondria blocked. // Science, – 1997. – V. 275. – N.5303, – Рp. 1129-1132.
8. Green D. R., Reed J. C. Mitochondria and apoptosis.// Science, – 1998. – V. 281. – № 5381, Рp. 1309-1312.
9. Allen R.G.,Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. // Free RadicBiol Med., 2000, v. 28, № 3, Pp. 463-499.
10. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов. // Биохимия, 2002, т. 67, № 3, С. 281-292.
11. Alam T.I., Kanki T. et al. Human mitochondrial DNA is packaged with TFAM // Nucleic Acids Res., 2003. V. 31, Pp. 1640-1645.
12. Schneider W.C., Hogeboom G.N. Cytochemical studies of mammalian tissues the isolation of cell components by differential centrifugation. // Cancer. Res. – 1951. – V. 19. – Pp. 1 – 22.
13. Алматов К.Т., Юсупова У.Р., Абдуллав Г.Р. ва бошқалар. Организмнинг нафас олиши ва энергия хосил қилишини аниқлаш.Тошкент. - 2013. – Б. 103.
14. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисная окисление липидов в биологических мембранах// – Москва: Наука. 1972. – С. 214.
15. Алматов К.Т. Механизмы развития повреждений мембран митохондрий и роль липолитической системы: дис. докт. биол. наук, Ташкент, – 1990. – 390 с.
16. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem., – 1951. – V. 193. – № 1. – Pp. 265 – 274.
17. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: Роль активных форм кислорода// Соросовский Образовательный Журнал. – 2001, – Т. 7, – №6, – С. 4-10.