Применение коллагеновых плёнок с включенным ex situ псораленом для фотодинамической терапии гнойных ран

АННОТАЦИЯ

Проведена оценка эффективности применения плёночных раневых покрытий CC-Ps на основе коллагена с введённым в него ex situ фуранокумарином (псораленом) из Ficus carica L. для терапии экспериментальных гнойных ран. Исследования проводились в сочетании с фотодинамической терапией на основе УФ-облучения в щадящем режиме и без УФ-облучения. В качестве контроля были нелеченые гнойные раны. Установлено, что использование раневых покрытий CC-Ps для терапии полнослойных гнойных ран экспериментальных животных приводит к значительному ускорению заживление ран в 1,38 раз по сравнению с контрольными не леченными ранами, а использование данных плёночных покрытий в сочетание с УФ-облучением приводит к ускорению регенерации ран в 1,49 раз.

ABSTRACT

Evaluation of the effectiveness of the use of CC-Ps film wound dressings based on collagen with ex situ introduced furanocoumarin psoralen from Ficus carica L. for the treatment of experimental purulent wounds was carried out. The studies were carried out in combination with photodynamic therapy based on UV irradiation in a gentle mode and without UV irradiation. Untreated purulent wounds were used as a control. It was found that the use of CC-Ps wound coatings for the treatment of full-thickness purulent wounds in experimental animals leads to a significant acceleration of wound healing by 1.38 times compared with untreated control wounds, and the use of these film coatings in combination with UV irradiation leads to an acceleration of regeneration wounds 1.49 times.

Ключевые слова: псорален, коллаген, УФ, регенерация.

Keywords: рsoralen, collagen, UV, regeneration.

Раневая инфекция кожи и подкожной клетчатки является одной из самых распространённых проблем хирургии прошлого и настоящего, хотя следует отметить, что введение антибиотикотерапии (АТБ) и всевозможной раневых покрытий (РП) значительно снизило данную проблему в современном мире. Так, среди гнойно-хирургических заболеваний (ГХЗ) раневая инфекция (РИ) составляет 12-22% [1].

Тактика ведения ран складывается из хирургических методов (хирургическая обработка, восстановительные операции, трансплантация, заместительная терапия) и местного лечения, включающего в себя использование РП, АТБ, фотодинамической терапии (ФДТ) и др. [4,10]. Основу современной медикаментозной терапии РИ составляет АТБ. Вместе с тем, несмотря на разработки новых поколений антибиотиков широкого спектра действия, они не могут предотвратить рост удельного веса местных инфекционных процессов и септикопиемии, сократить сроки лечения гнойных ран, так как огромные масштабы применения антибиотиков привели к появлению возбудителей инфекций с множественной антибиотикорезистентностью (АБР) [5,7]. Это побуждает исследователей искать растительные и синтетические соединения способные устранить АБР, а также разрабатывать новые РП и эффективные способы терапии РИ.

Фуранокумарины и, в частности, псорален хорошо известны как фотореактивные соединения [16]. Данный класс соединений часто используются в дерматологии в ФДТ ряда заболеваний, таких как витилиго, псориаз, атопическая экзема [14], воспалительных процессов кожи, слизистых желудочно-кишечного тракта [18]. Современные фармакологические исследования показали, что растения, богатые фуранокумаринами обладают антибактериальными [15], антидиабетическими [21], антидепрессивными [22], антиоксидантными [23], противогрибковыми [15], антибактериальными свойствами [12]. Комбинация использования псоралена с УФ излучением известно как терапия PUVA [11]. УфА-1 терапия с помощью ультрафиолета и фотосенсибилизирующих препаратов имеет ряд преимуществ перед другими методами фототерапии. В отличие от средне волнового диапазона Уф-лучи с длиной волны 340—400 нм способны более глубоко проникать в кожу и тем самым воздействовать на компоненты дермы (дермальные лимфоциты и дендритные клетки, фибробласты, тучные клетки, гранулоциты, экстрацеллюлярный матрикс) [6].

В этой связи, актуально исследовать активность псоралена, выделенного из Ficus carica L., введенного ex situ в состав коллагеновой плёнке совместно с ФДТ экспериментальных гнойных ран.

Материалы и методы исследований.

РП на основе коровьего коллагена (CC) и введённого в его состав псоралена (Ps) из Ficus carica L., получали методом ферментно-кислотной экстракции и методами ex situ, описанными ранее в работах Цеомашко Н.Е. и Абидовой А.Д. [9] и обозначили, как CC-Ps. В каждую плёнку CC-Ps вводили по 30 мкг псоралена, так как ранее нами было установлено, что в данной концентрации псорален проявляет наибольшие протективные свойства на мембранах клеток в экспериментах in vitro при УФ облучение клеток печени [2].

Модели гнойных ран смоделированы на беспородных белых крысах самцах массой 150-170 гр. Операции проводили под эфирным наркозом. На депиллированных участках спинок животных по трафарету формировали полнослойные кожные раны, размером 2,0 х 2,0 см. Размеченный квадратным трафаретом 2,0 х 2,0 см кожно-фасциальный лоскут иссекали острыми скальпелем. Мышечное дно раны раздавливали зажимом Кохера. Тампоны смачивали микробной смесью и наносили на ранки из расчёта на ранку 0,2 мл смеси, содержащей микроорганизмы следующих штаммов: №9572 Candida albicans Berkhant, №M-3-87 Staphylacoccus epidermitis, №ATCC 25922 Escherihia coli в концентрации 1х10⁵ микробных тел/мл. Каждое животное содержалось в отдельной клетке. Контроль за течением раневого процесса производили на основании: данных клинического наблюдения, таких как наличие или отсутствие в области раны отека мягких тканей, гиперемии кожных покровов, болезненности при манипуляциях; наличие или отсутствии на поверхности раны некротического детрита и раневого экссудата; отмечали время купирования явлений перифокального воспаления, появления грануляционной ткани, ее зрелости, начала эпителизации, сроков заживления; а также объективным критерием оценки течения раневого процесса служили данные гисто-морфологии зарубцованного участка.

Для оценки скорости заживления гнойных ран использовали планиметрические методы исследования по стандартной методике М.П.Толстых [8]. На рану накладывали стерильную пластину целлофана или полиакрила, на которую наносили контуры раны, а затем ее изображение переносили на миллиметровую бумагу и определяли размеры контуров на 5, 12 и 20 сутки.

В каждой группе животных было по 6 голов. Раны животных первой группы лечили CC-Ps, раны второй группы животных лечили обработкой CC-Ps и УФ лучами. Для этого, после промывки гнойных ран физ раствором, на раны наносили плёнки CC-Ps и оставляли усыплённых эфиром животных под УФ лучами с длиной волн 340 нм (источник излучения - кварцевая лампа мощностью 250 ватт находилась на высоте 1 м от животных) на 30 минут. Раны контрольной группы не подвергались обработке и лечению.

Статистический анализ выполняли с использованием специальных программ медицинской статистики, SSPS v10. и STATISTICA v 6.0. Полученные в ходе исследования цифровые данные были обработаны с применением методов статического анализа, принятых в современной медицинской науке. Статистическая обработка цифровых данных включала в себя расчет средних величин (М), определение среднеквадратического отклонения и средней математической ошибки (m). Определяли доверительный интервал (М+m). Различия признавали статистически значимыми при вероятности Р≤ 0,05.

Результаты и их обсуждения

Наиболее объективным способом экспериментального определения фотосенсибилизирующей активности фурокумаринов является метод Pathak и соав. [20], в частности, оценка активности при ФДТ, соответствующими лучами. Так, нами изучена фотосенсибилизирующая способность псоралена в составе коллагеновой плёнки CC-Ps на ранозаживляющую способность совместно с УФ-облучением и без. Экспериментальные раны наносили на выбритые спинки крыс (рис. 1).

Рисунок 1. Фотографии крыс: модель гнойной раны на выбритой спинке крыс, аппликации размером 2х2 см

Источник света находился на расстояние 100 см от поверхности кожи. Источником УФ света служил облучатель «кварц-3» с ДРТ-1000 лампой мощностью 250 ватт (ООО «Magnum medical servis», РУз). После облучения в течение суток проводили визуальное наблюдение за облученными участками кожи животных, а далее определяли размеры контуров на 5, 12 и 20 сутки (рис. 2, табл. 1).

Рисунок 2. CC-Ps + УФ (слева) и Контроль (справа) на 5, 12 и 20 сутки, соответственно

Таблица 1.

Влияние РП и ФДТ на изменение площади ран и сроков заживления (М ± м, n = 10)

Примечание: *P < 0,001 по сравнению с контролем

Как видно, из рисунка 2 и таблицы 1, применение CC-Ps совместно с ФДТ не значительно, но ускоряют заживление гнойных ран по сравнению с использованием просто CC-Ps без УФ-облучения, но статистически значимо (P < 0,001) оба способа терапии ран ускоряют процесс регенерации по сравнению с контролем, где терапия не применялась. Так, CC-Ps+УФ ускоряет заживление гнойных ран в 1,49 раз, а CC-Ps в 1,38 раз быстрее относительно контрольных ран.

Таким образом, в результате исследований показано, что РП на основе коллагена и фуранокумаринов и, в частности, псоралена, выделенного из среднеазиатских сортов Ficus carica L. стимулируют ранозаживляющую активность, ускоряя заживление обсемененных полнослойных ран кожи, что безусловно обеспечено как самим коллагеном – основным белком экстрацеллюлярного матрикса, как идеальной подложки для пролиферации клеток кожи фибробластов, так и псораленом, о чем свидетельствует небольшой рост регенеративного эффекта при сочетанном использование CC-Ps и ФДТ. Использование в терапии гнойных ран РП на основе коллагена и псоралена CC-Ps и, особенно, в сочетание с краткосрочным щадящим УФ-облучением значительно стимулирует регенерацию тканей за счет сокращения фазы воспаления в первую очередь, обусловленного не только коллагеном, но и псораленом, так как известно о противовоспалительной [12] и антиоксидантной активности псоралена в используемых концентрациях [2, 5, 23], ведь известно, что в септических ранах значительно повышается свободно-радикальный процесс. Кроме того, псорален обладает антимикробной активностью [15, 18], что и подтверждают наши исследования. Также подтверждается и то. Что активность псоралена, как фотосенсибилизатора активируется в щадящем режиме УФ облучения в диапазоне 312-340 нм.

Вывод

Терапия гнойных полнослойных экспериментальных ран с использованием раневых покрытий CC-Ps на основе коллагена и псоралена, выделенного из Ficus carica L. способствует ускорению заживление ран в 1,38 раз быстрее по сравнению с контрольными не леченными ранами, а использование данных плёночных покрытий в сочетание с УФ-облучением в щадящем режиме приводит к ускорению регенерации ран в 1,49 раз.

Список литературы:

1. Абакумов М.М. Хирургические инфекции // М.: Изд-во «Литтерра», 2006.-с.570
2. Абидова А.Д., Цеомашко Н.Е., Хегай Л.Н., Батыралиева Г.К., Ирискулов Б.У., Шамьянов И.Д., Нишанбаев С.З. Токсичность и фотосенсибилизирующая активность фурокумаринов, выделенных из листьев Ficus carica L.
3. Благонравова А.С. Сравнительная характеристика антибиотикорезистентности нозокомиальных и внебольничных возбудителей гнойно-септических инфекций в хирургии // IX Международный конгресс по антимикробной терапии. Москва, 2007. -c. 15.
4. Виноградов В.М. Заживление операционных ран с помощью комплекса лекарственных препаратов // Местное лечение ран Матер.Всесоюз. конф.-М.,1991.-с.199-200
5.  Михальска Тереза. Прооксидантное и антиоксидантное действие псораленов. Институт физики, Щецинский технологический университет Al. Piastow  Щецин, Польша. 48/49, 70-310.
6. Огарков П.И., Суборова Т.Н., Кузин А.А. и др. Оценка этиологической структуры инфекционных осложнений у пациентов хирургического стационара // Военно- медицинский журнал, 2009. № 11. -c. 46-47.
7. Страчунский Л.С., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничная MRSA - новая проблема антибиотикорезистентности // Клиническая микробиология и антимкробная химиотерапия, 2005. Т. 7. № 1. -c. 32-46.
8. Толстых М.П. Проблема комплексного лечения гнойных ран различного генеза и трофических язв //Дисс. на соискание уч. степени док. мед.наук.2002-М-360.
9. Цеомашко Н.Е., Абидова А.Д  Разработка новых биодеградируемых композиций раневых покрытий и изучение их регенеративных свойств.// Наука и инновационное развитие. 2019 №2 Ташкент.-с.63-74
10. Чадаев А.П., Климиашвили А.Д. Современные методики местного медикаментозного лечения инфицированных ран //РМЖ.-2002.-№26.-с.14-19
11. Cardoso, C.A.; Vilegas, W.; Honda, N.K. J.Pharm. Biomed. Anal. 2000, (2), 203-214.
12. Chen C.H., Hwang T.L., Chen L.C., Chang T.H., Wei C.S., Chen J.J. Isoflavones and anti-inflammatory constituents from the fruits of Psoralea corylifolia. Phytochemistry. 2017;143:186–193. doi: 10.1016/j.phytochem.2017.08.004.
13. Edelsonb, R.L. J.Photochem Photobiol 1991, (B10), 165-171
14. Elisabeth G Richard. The Science and (Lost) Art of Psoralen Plus UVA Phototherapy Review Dermatol Clin. 2020 Jan;38(1):11-23. doi: 10.1016/j.det.2019.08.002. Epub 2019 Oct 18
15. Kiran B., Lalitha V., Raveesha K.A. Antibacterial activity of bioactive compound isolated from seeds of Psoralea corylifolia L. against Gram positive and Gram negative bacterial species. J. Pharmacy Res. 2012;5:144–146.
16. Kitamura, N.; Kohtani, S.; Nakagaki, R. J.Photochem Photobiol C 2005, (6), 168-185.
17. Lehr, G.J.; Barry, T.L.; Franolic, J.D.; Petzinger, G. J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, (33), 627-637.
18. Lu Liu, Lei Zhang, Ze-Xu Cui, Xiao-Yan Liu, Wei Xu, Xiu-Wei Yang. Transformation of Psoralen and Isopsoralen by Human Intestinal Microbial In Vitro, and the Biological Activities of Its Metabolites. Molecules. 2019 Nov 12;24(22):4080. doi: 10.3390/molecules24224080
19. Mutzhas M.F., Holzle E., Hofmann C. et al. A new apparatus with high radiation energy between 320 and 460 nm: physical description and dermatological applications. J Invest Dermatol 1981; 76: 42—47.
20.  Pathak M.A., Parrish J.A., Fitzpatrick T.B. Psoralens in photochemotherapy of skin diseases.// Farmaco Sci.-1981.-36,-7.-p. 479-491
21. Seo E., Kang H., Oh Y.S., Jun H.S. Psoralea corylifolia L. seed extract attenuates diabetic nephropathy by inhibiting renal fibrosis and apoptosis in streptozotocin-induced diabetic mice. Nutrients. 2017;9:828. doi: 10.3390/nu9080828.
22. Yi L.T., Li Y.C., Pan Y., Li J.M., Xu Q., Mo S.F., Qiao C.F., Jiang F.X., Xu H.X., Lu X.B., et al. Antidepressant-like effects of psoralidin isolated from the seeds of Psoralea corylifolia in the forced swimming test in mice. Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2008;32:510–519. doi: 10.1016/j.pnpbp.2007.10.005
23.  Jan S., Parween T., Siddiqi T.O. Mahmooduzzafar, anti-oxidant modulation in response to gamma radiation induced oxidative stress in developing seedlings of Psoralea corylifolia L.J.Environ. Radioact. 2012;113:142–149.doi: 10.1016/j.jenvrad.2012.05.019.