Вазорелаксантное действие полифенольных соединений растений Euphorbia в зависимости от их химической структуры

АННОТАЦИЯ

В настоящей работе было исследовано вазорелаксантное действие в зависимости от химического строения двух полифенольных соединений 1-O-галлоил-6-O-бисгаллоил-2,4-валонеил-β-D-глюкозы (ПC-1) и 1-O-галлоил-2,3-гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкоза (ПC-2), выделенных из растений Euphorbia (зашифрованные как ПC-1 и ПC-2), на изометрические условия гладкой мускулатуры аорты крысы. Было установлено, что сосудорасширяющее действие ПС-1 (1-О-галлиол-6-О-бисгаллиол-2,4-валонеил-β-D-глюкоза) и ПС-2 (1-О-галлоил-2,3 -гексагидроксидифеноил-4,6-валонеил-β-D-глюкоза) в экспериментах зависит от их концентрации и химической структуры, а также блокировки Ca²⁺_L-канала плазмолеммы гладкомышечных клеток.

ABSTRACT

In the present study, on the isometric conditions of the rat aortic smooth muscle the vasorelaxant effect of the two polyphenol compounds 1-O-galloyl-6-O-bisgalloyl-2,4-valoneil-β-D-glucose (PC-1) and 1-O-galloyl-2,3-gexahydroxydiphenoil-4,6-valoneil-β-D-glucose (PC-2), isolated from Euphorbia plant speacies (encrypted as PC-1 and PC-2) depending on their chemical structure was investigated. It was obtained that the vasorelaxant effects of PC-1 (1-O-galliol-6-O-bisgalliol-2,4-valoneil-β-D-glucose) and PC-2 (1-O-galloil-2,3-hexagydroxidiphenoil-4,6-valoneil-β-D-glucose) in experiments depend on their concentration and chemical structure, as well as blockade the Ca²⁺_L – channel in the plasmolema of smooth muscle cells.

Ключевые слова: полифенольные соединения, кровяные тельца, гладкие мышцы, фенилефрин, блокаторы, Са²⁺_L–канал, α₁-адренорецептор, релаксантное действие.

Keywords: polyphenol compounds, blood vessels, smooth muscle, phenilephrine, blockator, receptor, Са²⁺_L–channel, α₁–adrenoreceptor, relaxant.

Введение. В наших предыдущих работах мы исследовали влияние новых полифенольных соединений, выделенных из растения молочай, на некоторые функциональные параметры митохондрий печени крыс [4, с. 1021; 1, с. 4]. Было установлено, что ПС-1 и ПС-2 эффективно влияют на некоторые функциональные параметры митохондрий. Например, данные соединения ингибируют открытие мегапоры митохондрий (mPTP), активируют АТФ-зависимый калиевый канал и обладают высокой антиоксидантной/антирадикальной активностью. Особо следует отметить, что эти соединения активируют АТФ-зависимый калиевый канал (митоКАТФ) в митохондриальных мембранах. Известно, что каналы mitoKATP играют важную роль в повреждении ишемической реперфузии (I/R) и апоптозе клеток [8, с. 93]. Также митоКАТФ проявляет широкий терапевтический интерес в качестве потенциальных мишеней при ряде сердечно-сосудистых заболеваний, таких как аритмия, стенокардия и сердечная недостаточность. В последние годы наблюдается высокий рост интереса к роли активации канала митоКАТФ в патогенезе сердечной дисфункции. В связи с этим наша дальнейшая работа заключалась в исследовании сосудорасширяющей активности соединений ПС-1 и ПС-2, выделенных из растения молочай, произрастающего на территории Узбекистана.

Осложнения сердечно-сосудистой патологии (инфаркт миокарда, инсульт и др.) составляют одну из важнейших причин смертности и заболеваемости в мире [6, с. 1143]. Эти осложнения, которым часто способствует высокое артериальное давление, появляются среди основных причин смерти. Действительно, по мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), высокое кровяное давление и гиперхолестеринемия встречаются в развивающихся странах чаще, чем предполагалось. Среди факторов риска, за исключением гиперхолестеринемии, – ожирение, наркомания и диабет, которые являются основными факторами, способствующими развитию этих заболеваний [7, с. 9]. Принимая во внимание частоту этих состояний, интенсивно ведется поиск соединений, обладающих вазорелаксантным действием [9, с. 3].

В настоящее время полифенольные соединения были выделены из более чем 400 растений, и многие исследователи подробно изучили классификацию, синтез/биотрансформацию этих полифенолов и широкий спектр фармакологической активности. Одним из потенциальных источников полифенолов является растение молочай. Растение Euphorbia является наиболее распространенным видом в горном регионе. В народной медицине растение молочай применяет как жаропонижающее, болеутоляющее, а также при лечении гастрита, тонзиллита, противовоспалительного, артериального давления, заболеваний печени, лечения малярии [10, с. 258].

Научные сотрудники Института биоорганической химии Академии наук Республики Узбекистан выявили ряд полифенолов, обладающих сосудорасширяющим действием, и установили взаимосвязь между структурой и активностью. Некоторые из них, в частности, содержат валонеильную группу (C21O15H14) в молекуле. Например, замена группы гексагидроксидифеноила (C14O10H10) в углероде (2,3) вместо бисгаллоила (C14O9H10) в углероде глюкозы (6) молекулы ПC-1 увеличивает сосудорасширяющую активность [5, с. 170; 14, с. 1].

Рисунок 1. Химическая структура полифенольных соединений ПC-1 (A) и ПC-2 (B), выделенных из растений Euphorbia humifusa и Euphorbia franchetii

Целью данного исследования является анализ зависимости от химической структуры вазорелаксантного действия полифенолов ПС-1 и ПС-2 на изометрическое состояние гладких мышц аорты крыс.

Материалы и методы. Препарат сосудов аорты выполняли стандартными методами.

Эксперименты проводились на здоровых белых крысах (180–200 г), получавших стандартные питательные и водные условия. Подопытным животным хирургическим путем удалили и разрезали кольцевые сегменты (l = 2–4 мм; ø = 1–2 мм). В экспериментах использовался физиологический раствор Кребса – Хенселейта следующего химического состава (в мМ): NaCl – 120,4; KCl – 5; Na₂HCO₃ – 15,5; NaH₂PO₄ – 1,2; MgCl₂ – 1,2; CaCl₂ – 2,5; C₆H₁₂O₆ – 11,5 (pH = 7,4) (Ozaki et al., 1990). Физиологический раствор аэрировали карбогеном (O₂ – 95 % и CO₂ – 5 %), а постоянную температуру (t = +37 ± 0,5 °C) обеспечивали ультразвуком (U-8; Болгария). Активность сокращения сосудов аорты регистрировали в изометрических условиях с помощью датчика мощности FT-03 (Grass Instrument Co., США), усилителя сигнала [13, с. 63; 3, с.1]. Влияние полифенолов на Ca²⁺_L-канал оценивали по амплитуде силы сокращения, вызванной KCl (50 мМ) (Hoe et al., 2011). Влияние исследуемых полифенолов на резервный Ca²⁺-канал (SOCC – Ca²⁺-каналы)/Ca²⁺-зависимые рецепторы (ROCC – Ca²⁺-каналы, управляемые рецепторами), сила амплификации, индуцированная фенилэфрином (1 мкМ), оценивались.

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Origin 6 (OriginLab Corporation, США). Данные были оценены с помощью параметрического критерия Стьюдента, который выражали как M±m. Доверительный интервал выражается при * – Р < 0,05; ** – Р < 0,01; *** – Р < 0,001.

Результаты и обсуждения. В нашей работе, учитывая, что полифенолы обладают широким спектром биологической активности и проявляют эффективное воздействие на многочисленные патологические состояния, такие как сердечно-сосудистые заболевания, нами было исследовано вазорелаксантное действие выбранных полифенольных соединений ПC-1 и ПC-2. Полученные данные показали, что полифенольные соединения ПC-1 и ПC-2 обладают значительным сосудорасширяющим действием на изометрическую сократительную активность (in vitro) аорты крысы при предварительной обработке 50 мМ KCl. В частности, было обнаружено, что ПС-1 при минимальной концентрации 10 мкМ снижает силу сокращения на 9,4 ± 3,8 %, а при максимальной концентрации 60 мкМ (n = 4–6) – до 70,6 ± 5,1 % по сравнению с контролем. Также было установлено, что ПС-2 при минимальной концентрации 5 мкМ снижает силу сокращения на 29,5 ± 4,9 %, а при максимальной концентрации 30 мкМ – до 89,4 ± 5,3 % по сравнению с контролем. Значения (EC₅₀) для ПС-1 и ПС-2 составляли 33,9 мкМ и 9,6 мкМ соответственно (рис. 2 A и B).

Рисунок 2. Концентрационно-зависимое вазорелаксантное действие полифенолов ПС-1 (А) и ПС-2 (B) на сокращение препарата аорты, вызванное КСl (50 мМ). Ось Y – сила сокращения от 50 мМ КСl (100 %). По оси абсцисс – концентрация полифенольного соединения мкМ (* – р < 0,05; ** – р < 0,01; n = 4–6)

Известно, что L-каналы ответственны за возбуждения и сокращения сердечных мышц. Таким образом наше дальнейшее исследование заключалось в изучении роли потенциал-зависимых каналов Ca²⁺_L-типа в релаксантном эффекте полифенолов ПС-1 и ПС-2. Было исследовано их влияние на сокращение препарата аорты, вызванное кумулятивным добавлением CaCl₂ к бескальциевой среде с 50 мМ KCl. В этих экспериментах использовали CaCl₂ (0–2,5 мМ) в среде инкубации, приводящий к увеличению концентрации Ca²⁺ через каналы Ca₂₊ каналы L-типа (рис. 3 A). Присутствие исследуемых полифенолов в инкубационной среде значительно снижает увеличение силы сокращения в ответ на увеличение CaCl₂ (рис. 3 A). Эти результаты показывают, что релаксантный эффект исследуемых полифенолов зависит от снижения проницаемости ионов Ca²⁺ через Ca²⁺-каналы L-типа и может быть связан с уменьшением [Са²⁺]_in в клетке.

Далее было исследовано участие Са²⁺ каналов L-типа в релаксантных эффектах полифенолов ПС-1 и ПС-2. Для установления механизма релаксантного действия исследуемых полифенолов был использован специфический блокатор канала – верапамил. Было замечено, что в присутствии верапамила EC₅₀ = 0,1 мкМ релаксантный эффект полифенолов снижался. В этих условиях различные концентрации ПС-1 (ЕС₅₀ = 33,9 мкМ) и ПС-2 (ЕС₅₀ = 9,6 мкМ) были дополнительно снижены до 5,1 ± 3,3 % (55,1 ± 4,3 % по сравнению с контролем) и 9,7 ± 3,8 % (59,7 ± 5,4 % по сравнению с контролем) соответственно (рис. 3 Б).

Рисунок 3. Зависимость релаксантного действия полифенолов ПС-1 и ПС-2 от концентрации [Ca²⁺] и состояния потенциалзависимых Ca²-каналов L-типа. A – влияние полифенолов ПC-1 и ПC-2 на предварительную обработку сокращения аорты крысы путем кумулятивного добавления CaCl₂ к растворам Кребса. Ось Y – 100 % 50 мМ КСl. Ось X – концентрация СаCl₂. Б – релаксантное действие ПС-1 и ПС-2 на сокращение мышц до обработки 50 мМ КСl при наличии верапамила (0,1 мкМ) (* – р < 0,05; ** р < 0,01; n = 4–6)

Полученные результаты дают основание полагать, что релаксантный эффект полифенолов ПС-1 и ПС-2 обусловлен блокадой Са²⁺-каналов L-типа. Однако проявление незначительного сосудорасширяющего действия ПС-1 и ПС-2 в присутствии верапамила в среде инкубации наряду с блокадой Са²⁺ каналов L-типа могут быть задействованы и другие механизмы в снижении транспорта ионов Са²⁺ в гладкомышечных клетках.

Кроме того, помимо потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов, рецептор регулируемые Ca²⁺-каналы играют важную роль в регуляции гомеостаза Ca²⁺ в гладкомышечных клетках [2, с. 158]. Чтобы оценить влияние полифенолов на рецептор, регулируемые Ca²⁺-каналы в последующих экспериментах исследовали сокращение мышц аорты, вызванное фенилфрином (FE), который является агонистом α1-адренорецепторов.

В наших экспериментах изучали влияние полифенолов на силу сокращения аорты, индуцированную ФЭ под действием блокатора Са²⁺-каналов L-типа – верапамила. В этих условиях сокращение мышц, вызванное ФЭ, было на 13,7 ± 2,8 % ниже, чем в условиях без верапамила. В этих условиях полифенолы ПС-1 (40 мкМ) и ПС-2 (25 мкМ) снижали сокращение аорты, вызванное ФЭ, максимум до 89,4 ± 5,4 % и 83,3 ± 4,9 % соответственно (рис. 4. A и B).

Рисунок 4. Влияние ПС-1 и ПС-2 на сокращение аорты крысы, вызванное фенилэфрином. Ось Y – 100 % предварительная обработка силы сокращения аорты 1 мкМ ФE. Ось X – концентрация полифенолов (* – р < 0,05; ** – p < 0,01; n = 4–6)

В этих экспериментах значения EC₅₀ полифенолов ПС-1 и ПС-2 составляли 12,6 мкМ и 13,5 мкМ соответственно. Результаты показывают, что наблюдаемые эффекты полифенолов можно отнести к блокаде регулируемых рецептором Ca²⁺-каналов. Дополнительные доказательства влияния изученных полифенолов на регулируемые рецепторами Ca²⁺-каналы могут быть объяснены экспериментами с блокатором α-адренорецепторов фентоламином (ФA). В наших экспериментах релаксантный эффект полифенолов ПС-1 (40 мкМ) и ПС-2 (25 мкМ) в присутствии 10 мкМ фентоламина показал снижение ФE на 48,9 ± 5,7 % и 43,2 ± 4,1 % по сравнению с полифенолами без фентоламина (рис. 5).

Рисунок 5. Влияние фентоамина (10 мкМ) на релаксантный эффект ПС-1 и ПС-2. Ось Y – 100 % сила сокращения аорты 1 мкМ ФE (* – р < 0,05; ** – р < 0,01; n = 4–6)

Полученные результаты показывают, что релаксантный эффект исследуемых полифенолов может быть связан с блокадой рецептор контролируемых Ca²⁺-каналов.

Данные настоящего исследования подтверждают, что полифенолы ПC-1 и ПC-2, выделенные из видов растений Euphorbia, могут вызывать расслабление препарата аорты крыс. Полифенольные соединения, выделенные из видов растений Euphorbia, демонстрируют относительно большую релаксацию, которая в основном зависит от присутствия эндотелия и высвобождения NO.

Известно, что биологическая активность полифенольных соединений во многом зависит от их химической структуры, от количества гидроксильных групп в бензольном кольце, их положения, степени экранирования, а также от природы других заместителей, влияющих на электронную плотность соединения [11, с. 48]. В литературе также приводятся данные о том, что расположение гидроксильных групп в бензольном кольце играет большую роль в проявлении биологической активности, чем их количество [12, с. 58]. Наличие нескольких гидроксильных групп в бензольном кольце, особенно в орто- и параположениях друг к другу, особенно чувствительно к действию окислителей. Такие фенолы очень легко окисляются и являются хорошими восстановителями. Например, гидроксильные группы в ортоположении испытывают внутримолекулярное отталкивание; следовательно, их АОА увеличивается по сравнению с изомерами, в которых гидроксильные группы находятся в метаположении.

Однако, несмотря на большой интерес к полифенолам, публикаций о влиянии структуры их молекул на кардиопротекторную активность немного. Тем не менее, учитывая, что эти соединения имеют в своей молекуле 16 гидроксильных групп, ПC-2 проявляет более выраженную вазорелаксирующую активность, чем ПC-1. Возможно, это связано с наличием в молекуле ПС-2 гексагидроксидифенильной группы. Ранее мы описали, что в случае ПС-2 наблюдалась более выраженная антиоксидантная активность, чем в случае ПС-1. Возможно, это связано с большим количеством и расположением гидроксильных групп в их молекуле, которые могут служить электронодонорными функциональными группами в молекулах, а также с наличием гексагидроксидифенильной функциональной группы.

Мы описали выше, что исследование сосудорасширяющего действия этих соединений было основано на том факте, что они активируют АТФ-зависимый калиевый канал, который играет важную роль в кардиопротекции. Коэффициент корреляции между активацией АТФ-зависимого калиевого канала и сосудорасширяющим эффектом ПС-2 составляет R² = 0,78.

Выводы. Полифенолы ПC-1 и ПC-2 обладают расслабляющим действием и эффективно снимают вызванное раствором гиперкальция и фенилэфрином сокращение аорты крысы. Выяснено, что ПС-2 обладает более выраженным сосудорасширяющим действием.

На основании анализа литературы и экспериментальных результатов сделан вывод, что сосудорасширяющее действие полифенольных соединений ПС-1 и ПС-2 на изометрическое сокращение сосудистой сети аорты крысы в ​​условиях in vitro может быть в основном связано с блокадой регулируемых рецепторами Са²⁺-каналов.

Научные/экспериментальные результаты могут быть использованы в качестве теоретической основы для разработки антиперентативных фармакологических препаратов на основе полифенолов.

Список литературы:

1. Antioxidant and Membrane-Active Properties of 1,4,6 tri-o-galloyl-2,3-valoneyl-β-d-glucose / U.G. Gayibov, E.J. Komilov, R.N. Rakhimov, N.A. Ergashev [et al.] // European Journal of Medicine. Series B. – 2018. – № 5 (1). – P. 3–15.
2. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle / H. Karaki, H. Ozaki, M. Hori [et al.] // Pharmacological Reviews. – 1997. – № 49 (2). – P. 158–229.
3. Cherkaoui-Tangi K., Israili Z.H., Lyoussi B. Vasorelaxant effect of essential oil isolated from Nigella sativa L. seeds in rat aorta: Proposed mechanism. Pak. // J. Pharm. Sci. – 2016. – № 29 (1). – P. 1–8.
4. Influence of new polyphenol compound from Euphorbia plant on mitochondrial function / U.G. Gayibov, E.J. Komilov, R.N. Rakhimov, N.A. Ergashev [et al.] // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. – 2019. – № 8 (4). – P. 1021–1025.
5. Influence of valoneoyl groups on the interactions between Euphorbia tannins and human serum albumin / S. Sekowski, M. Bitiucki, M. Ionov, M. Zdeb [et al.] // Journal of Luminescence. – 2018. – № 194. – P. 170–178.
6. Lazzini A., Lazzini S. Cardiovascular disease: an economical perspective // Curr Pharm Des. – 2009. – № 15. – P. 1142–1156.
7. Misra A., Khurana L. Obesity and the metabolic syndrome in developing countries // J Clin Endocrinol Metab. – 2008. – № 93. – P. 9–30.
8. Mitochondrial ATP-Sensitive Potassium Channels and Cardioprotection / R. Ankur, M. Arti, R. Seema, K. Ashok // International Journal of Drug Development & Research. – 2012. – № 4 (2). – P. 92–98.
9. Ostadal B. The past, the present and the future of experimental research on myocardial ischemia and protection // Pharmacol Rep. – 2009. – № 61. – P. 3–12.
10. Rakhimov R.N., Abdullajanova N.G., Kamaev F.G. Phenolic compounds of Euphorbia canescens and E.franchetii // Chemistry of natural compounds. – 2011. – № 2. – P. 258–259.
11. Structure – Activity relationship of flavonoids active against hard oil oxidation based on quantum chemical analysis / J.-G. Yang, B.-G. Liu, G.-Zh. Liang, Zh.-X. Ning // Molecules. – 2009. – Vol. 14. – P. 46–52.
12. Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of Flavonoids / D. Amič, D.D. Amič, D. Bešlo, N. Trinajstič // Croat. Chem. Acta. – 2003. – V. 76 (1). – P. 55–61.
13. Vascular activity of a natural diterpene isolated from Croton zambesicus and of a structurally similar synthetic trachylobane / A. Martinsen, C. Baccelli, I. Navarro, A. Abad [et al.] // Vascular Pharmacology. – 2010. – № 52. – P. 63–69.
14. Vasorelaxant and hypotensive effects of cheonwangbosimdan in SD and SHR rats / B. Kim, C. Jo, H-Y. Choi, K. Lee // Hindawi Evidence–Based Complementary and Alternative Medicine. – 2018. – № 1–8.