Способность бактерий рода Acinetobacter синтезировать наночастицы серебра и их антибактериальная активность

АННОТАЦИЯ

Целью исследования являлось проверить и изучить способность микроорганизмов рода Acinetobacter синтезировать наночастицы серебра и их антибактериальная активность. Бактерии рода Acinetobacter проявляют устойчивость при добавлении водного раствора AgNO₃ различных концентраций ионов серебра и способны к биосинтезу наночастиц. Максимальное количество образования наночастиц серебра и наибольшая антибиотическая активность биогенных наночастиц наблюдались после добавления 100 мг/л ионов серебра. Размер полученных биогенных наночастиц серебра варьируются от 20 до 300 нм, которые затем образуют агломераты с размерами от 150 до 500 нм.

ABSTRACT

The aim of the study was to test and study the ability of microorganisms of the genus Acinetobacter to synthesize silver nanoparticles and their antibacterial activity. Bacteria of the genus Acinetobacter are resistant to the addition of an aqueous solution of AgNO₃ of various concentrations of silver ions and are capable of biosynthesis of nanoparticles. The maximum amount of formation of silver nanoparticles and the highest antibiotic activity of biogenic nanoparticles were observed after the addition of 100 mg / l of silver ions. The size of the biogenic silver nanoparticles obtained varies from 20 to 300 nm, which then form agglomerates with sizes from 150 to 500 nm.

Ключевые слова: микроорганизмы, наночастицы серебра, Acinetobacter, биосинтез, антибактериальная активность.

Keywords: microorganisms, silver nanoparticles, Acinetobacter, biosynthesis, antibacterial activity.

Введение

В настоящее время одной из быстро развивающихся областей нанотехнологии становится создание и использование наночастиц различных металлов. Особое внимание в последнее время обращено на наночастицы серебра. Бактерицидные и ранозаживляющие свойства серебра известны медицине давно. Но если серебро и прочие металлы использовать в виде наночастиц, эти свойства резко усиливаются. Применение серебра в наноразмерных формах позволяет в сотни раз снизить концентрацию металлического серебра с сохранением бактерицидных свойств этого металла в химически чистой форме [2, c. 30].

Наночастицы серебра обладая широким спектром высокой антимикробной активности во многом лишены недостатков, связанных с проблемой резистентности к ним патогенных микроорганизмов. Чувствительность разных патогенных и непатогенных организмов к серебру неодинакова. Патогенная микрофлора намного более чувствительна к ионам серебра, чем непатогенная. Поэтому серебро действует избирательно, в большей степени уничтожая вредные микроорганизмы [1, с. 170].

Наночастицы серебра средним размером 3-4 нм получают с помощью физических, химических и биологических методов. Однако последние являются наиболее предпочтительными, поскольку они экологичны и безопасны. Так с помощью биохимических и биотехнологических подходов наночастицы серебра могут быть получены в стабилизированных водных растворах AgNO₃ с использованием в качестве стабилизаторов и восстановителей органических соединений: желатина, глюкозы, декстрана или продуктов гидролиза клеточных стенок микроорганизмов. При росте в присутствии ионов серебра некоторые микроорганизмы и грибы способны продуцировать в цитоплазматическом пространстве плоские полиэдрические наночастицы серебра с размерами 50–100 нм [5, с.49].

Согласно этому, определенный интерес представляет поиск наиболее активных микробных продуцентов наночастиц серебра, с целью выявления биообъектов, способных к максимально быстрому и эффективному синтезу наночастиц серебра [3–4, c. 26, c. 160], [6, c. 74].

Целью данного исследования являлось проверить и изучить способность микроорганизмов рода Acinetobacter синтезировать наночастицы серебра при добавлении различных концентраций ионов серебра, а также определить антибактериальную активность биогенных наночастиц по отношению условно-патогенных микроорганизмов.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись бактерии рода  Acinetobacter, выделенные из сточных вод. Культивирование бактерий осуществлялось на мясопептонном бульоне (МПБ) со значениями рН=8.0.

Для синтеза наночастиц через 48 часов культивирования в культуральную жидкость (КЖ) с биомассой вносили водный раствор AgNO₃ в дозах 25 мг/л, 50 мг/л, 75 мг/л, 100 мг/л Ag+, далее инкубировали в качалочных условиях с постоянным перемешиванием при 150 об/мин при температуре 28-30^ºС в течение 72 часов и более. 

В качестве контроля на все варианты была использована КЖ на мясопептонном бульоне (МПБ) без добавления AgNO₃и с исходным значением рН среды равной 7.0.

Образование НЧ серебра фиксировали визуально по изменению цвета растворов КЖ в характерный бурый и коричневый цвета. Количественный учет биомассы проводили путем высева предельных разведений в чашки Петри на мясопептонный агар (МПА) с последующей инкубацией в термостате при температуре 28^ºС. Через 2–3 суток подсчитывали колонии.

Антибактериальную активность биогенных наночастиц серебра проводили на 3 сутки инкубации методом агаровых лунок, где в качестве тест-культур использовали условно-патогенные бактерии Staphilococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis и Candida albicans, предоставленных коллекцией микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

Результаты и обсуждение

Способность синтезировать наночастицы серебра бактериями рода Acinetobacter фиксировали визуально (рис.1). Проведенные эксперименты показали, что интенсивное изменение цвета КЖ от желтого до темно-коричневого с внесенным раствором AgNO₃ наблюдалось по прошествии 48 часов культивированияв образцах с содержанием ионов серебра от 50 мг/л до 100 мг/л.

Рисунок 1. Образование НЧ серебра КЖ Acinetobacter:

где К – контроль (КЖ); №1 – КЖ+25мг Ag+; №2 – КЖ+50мг Ag⁺; №3 – КЖ+75мг Ag+; №4 – КЖ+100мг Ag+.

Количественный учет биомассы в процессе биосинтеза наночастиц позволил установить, что данные бактерии рода Acinetobacter проявляют устойчивость к действию солей тяжелых металлов и способность к биосорбции серебра. КОЕ бактерий колебалась в пределах 100–114·10⁶ на 4 сутки биосинтеза НЧ, по прошествии 8 суток биосинтеза НЧ – КОЕ снижалась до значений 17·10⁴.

Проведенные исследования также позволили определить фактор влияния размера внесенной биомассы бактерий для получения наночастиц серебра. Установлено, что наиболее оптимальным является внесение 3,25·10⁵ кл/мл.

Исследование антимикробной активности полученных биогенных НЧ серебра показало, что наибольшую антибиотическую активность проявляли наночастицы, синтезированные бактериями в концентрации 100 мг/л ионов серебра по отношению к тест-культурам Staphilococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, кроме Candida albicans, в то время как остальные концентрации 25 мг/л, 50 мг/л, 75 мг/л серебра не оказывали никакого бактерицидного действия на рост всех тест-культур патогена, за исключением непатогена Bacillus subtilis (Табл. 1). Повышение концентрации до 200 мг/л Ag+ также не вызвало появления антимикробной активности по отношению к Candida albicans. Зона подавления роста патогенных тест-культур вокруг лунки с биогенными наночастицами, синтезированных при концентрации 100 мг/л составляет от 3 до 10 мм.

Таблица 1.

Антибактериальная активность биогенных наночастиц, синтезированных бактериями рода Acinetobacter при различных концентрациях ионов серебра

Таким образом, механизм действия серебра на микробную клетку заключается в том, что ионы серебра сорбируются клеточной оболочкой, которая выполняет защитную функцию. Клетка остается жизнеспособной, но при этом нарушаются некоторые ее функции, например, деление (бактериостатический эффект). Как только на поверхности микробной клетки сорбируется серебро, оно проникает внутрь клетки и ингибирует ферменты дыхательной цепи, а также разобщает процессы окисления и окислительного фосфорилирования в микробных клетках, в результате чего клетка гибнет [1, с. 170].

Синтезированные наночастицы стабилизированы хитозаном Bombyxmori и получены пленки методом сухого формования. Образцы идентифицированы спектральными и микроскопическими методами. Результаты проведенных исследований показывают, что размеры полученных биогенных наночастиц серебра варьируются от 20 до 300 нм, которые затем образуют агломераты с размерами от 150 до 500 нм. Следует отметить, что с повышением содержания ионов серебра в реакционной системе, увеличивается не только размер наночастиц, но и меняется их форма из сферического до игольчатого.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что данные исследований показывают возможность бактерий рода Acinetobacter синтезировать наночастицы серебра, что в дальнейшем позволяет использовать их для получения серебряных наночастиц так называемым «зеленым» методом биологического производства наночастиц.

Список литературы:

1. Букина Ю.А., Сергеева Е.А. Антибактериальные свойства и механизм бактерицидного действия наночастиц и ионов серебра // Вестник Казанского технологического университета. – 2012. – Т. 14. – № 15. – С. 170–172.
2. Гарасько Е.В., Шиляев Р.Р., Чуловская С.А., Парфенюк В.И. Применение наноразмерных частиц серебра в медицине // Вестник Ивановской медицинской академии. – 2008. – Т.13. – № 3–4. – С. 30–34.
3. Зайнитдинова Л.И., Куканова С.И., Ташпулатов Ж.Ж., Лобанова И.В. Скрининг коллекционных культур продуцентов наночастиц. // Microbiology and virology. – Алматы – 2018. – № 1 (20). – С. 26–33.
4. Zaynitdinova L.I., Tashpulatov J.J., Kukanova S.I., Lobanova I.V. Bacteria–potential producer of nanoparticles. // International Journal of Molecular Biology: Open Access. – 2018. Vol.  3 (3). – P. 160–162.
5. Мосин О.В., Игнатов И. Коллоидное серебро в бионанотехнологии // Биотехносфера. – 2012. – № 5–6 (23–24). – С. 49–55.
6. Тюпа Д.В., Алексеева Л.С., Калёнов С.В., Кузнецов А.Е. Поиск наиболее активных микробных продуцентов наночастиц серебра // Успехи в химии и химической технологии. – 2014. – Том XXVIII. – № 5. – С. 74–77.