Сравнительная биологическая активность супрамолекулярных комплексов рутина

АННОТАЦИЯ

Получены супрамолекулярные комплексы глицирризиновой кислоты (ГК) и ее моноаммониевой соли с флавоноидом рутином в различных молярных соотношениях. Сравнительная активность этих комплексов на моделях in vivo показали бóльшую эффективность комплекса ГК с рутином (р<0,05). При одинаковой дозе введения супрамолекулярный комплекс ГК с рутином в молярном соотношении 4:1 оказался более эффективным по капилляропротекторным (р<0,05) и антиоксидантным свойствам, чем другие соотношения и самого рутина. Дальнейшие исследования рекомендовано проводить именно с этим комплексом, при низких дозах введения.

ABSTRACT

Supramolecular complexes of glycyrrhizic acid (GA) and its monoammonium salt with the flavonoid rutin in various molar ratios have been obtained. The comparative activity of these complexes in in vivo models showed a greater efficiency of the GA complex with rutin (p <0.05). At the same dose of administration, the supramolecular complex of GA with rutin in a molar ratio of 4:1 turned out to be more effective in capillaroprotective (p <0.05) and antioxidant properties than rutin itself. Further studies are recommended to be carried out with this complex, at low doses of administration.

Ключевые слова: супрамолекулярный комплекс, глицирризиновая кислота, моноаммониевая соль, флавоноид, рутин, капилляропротекторы, антиоксиданты.

Keywords: supramolecular complex, glycyrrhizinic acid, monoammonium salt, flavonoid, rutin, capillary protectors, antioxidants.

В настоящее время в создании лекарственных препаратов и медицинских изделий стали использоваться нанотехнологии, т.е. технологии, которые позволяют контролировать, манипулировать, изучать и изготавливать конструкции и устройства в диапазоне размеров «нанометров». Эта быстро развиваемая область предоставляет новые возможности в диагностике и лечении заболеваний. Происходит это благодаря тому, что наноразмерные объекты, например «наночастицы», приобретают новые свойства и функции, которые заметно отличаются от тех, которые наблюдаются у изделий из идентичных материалов. Улучшенная растворимость и многофункциональность наночастиц продолжают открывать многие двери и создавать новые биомедицинские изделия, структуры, устройства и системы в наномасштабе[3, с. 55]. В качестве подобного носителя предложено использовать ГК и ее производные, представляющие собой тритерпеноиды корней и корневищ солодки, Glycyrrhiza glabra. Для них показана собственная антиоксидантная, противовоспалительная, отхаркивающая, противоязвенная, антимикробная, противовирусная, гепатопртекторная, противоопухолевая, нейропротективная, седативная, антидепрессивная и др. активности [4, с. 2453; 5, с. 2323; 6, с. 272-273].

При этом ГК и ее производные способны усиливать активность других препаратов, образовывая самоассоциаты в водных и неводных средах, а также водорастворимые комплексы с широким спектром липофильных препаратов, что повышает их биодоступность; позволяет включаться в липидный бислой и увеличивать текучесть и проницаемость мембраны для лекарственных препаратов [6, с. 274-277]. В итоге ГК и ее производные выступают двояко в системе комплекса: и как непосредственно действующее вещество с собственными высокими потенциями, и как носитель другого активного агента. 6, с. 274

Поскольку фармакопейный препарат рутин, для которого показано наличие антиоксидантной, противовоспалительной, цитопротекторной, вазопротекторной, противоопухолевой, нейро- и кардиопротекторной, антимикробной, противовирусной, и др. видов активности [2, c. 149], является плохо растворимым веществом, для улучшения его биодоступности использованы различные способы [1, c. 233]. В свою очередь нами предложено использовать ГК и моноаммониевую соль ГК (глицирам) в качестве носителя этого препарата.

Целью данной работы является сравнить два варианта низкодозовых комплексов рутина на капилляропротекторную и антиоксидантную активность.

Материалы и методы

Исследуемые препараты: 1) рутин, 2) глицирризиновая кислота (ГК), 3) супрамолекулярный комплекс ГК с рутинном – Г/Р (ГК, 90-92% чистоты, выделенная из корня солодки, молярное соотношение комплекса ГК:рутин составляет 4:1); 4) моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (МАСГК); 5) супрамолекулярный комплекс МАСГК с рутином – М/Р (МАСГК, 90-92% чистоты, мольное соотношение комплекса МАСГК:рутин - 4:1).

Суточная доза рутина не определена регламентирующими агентствами, поэтому расчет дозы рутина в пересчете на крысу проводили исходя из минимальных рекомендуемых терапевтических доз (ТД) для фармакопейного препарата рутин согласно Реестру лекарственных средств России: 60-160 мг в сутки [12], а также максимальной дозы рутина в биологически активных добавках различного производства: 500 мг [10, 11]. Исходя из расчетных показателей, дозы введения рутина крысам составляют в среднем от 5 до 45 мг/кг. В наших исследованиях определение биологической активности препаратов проводили при введении минимальной дозы (5 мг/кг) в случае развития модели воспаления и средней дозы (20 мг/кг) при воздействии на интактные животные.

Оценка капилляропротекторного действия препаратов

Оценку капилляропротекторного действия исследуемых препаратов проводили по изменению сосудистой проницаемости под действием воспалительных агентов, а именно по выходу трипановой сини в очаг воспаления. Для создания асептического воспаления на заднюю лапку мыши наносили 0,02 мл ксилола. За 10 мин до этого животным внутрибрюшинно вводили 0,3 мл 0,3% водного раствора красителя трипанового синего. Исследуемые препараты вводили перорально однократно в дозе 5 мг/кг веса животного за 2–2,5 ч до введения красителя, в контроле – дистиллированная вода в соответствующем объеме [8, с. 742]. Для оценки степени проницаемости капилляров фиксировали начало времени выхода красителя в воспаленный участок. 

Оценка антиоксидантных свойств препаратов

Все исследуемые препараты вводили перорально в течение 7 дней интактным животным в дозе 20 мг/кг массы тела животного, контрольные крысы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме. На 8-е сутки проводили забой животных соответственно Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Митохондрии из печени опытных крыс выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования. После декапитации животного печень извлекали и промывали в ледяном буфере А следующего состава в мМ: 250–сахароза; 10 –трис –НСL, рН-7,6; 1 – ЭДТА. Далее ткань взвешивали и продавливали через пресс, частично избавляясь таким образом от соединительной ткани. Полученную массу гомогенизировали в буфере А в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Полученный гомогенат центрифугировали в рефрижераторной центрифуге ЦЛР - 1 с ротором углового типа при 1500 об/мин. в течение 10 минут при 0-2^оС. При этом осаждаются неразрушенные клетки, клеточные осколки, ядра и другие частицы. После центрифугирования супернатант осторожно отбирали и центрифугировали при 4000 об/мин. 20 минут при 0-2^оС. Полученный осадок суспендировали, промывали буфером А и вновь центрифугировали в тех же условиях. Полученные в осадке митохондрии использовали в течение 1,5 часов и хранили при 0-2^оС. 

Далее определяли уровень малонового диальдегида (МДА), цитотоксического продукта перекисного окисления жирных кислот. Для этого осадок, содержащий митохондрии отмывали от сахарозы в среде, содержащей в мМ: 125 –КСl; 10 – трис –НСl, рН -7,5. Добавляли индукторы перекисного окисления липидов, ставили на 15 мин. для инкубации; затем после охлаждения для остановки реакции добавляли 5 мл ледяной уксусной кислоты (СН₃СООН). После центрифугирования к 2 мл супернатанта добавляли 1 мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты (ТБК). 70 мг ТБК растворяли в 5 мл дистиллированной воды при нагревании. Пробы нагревали 15 мин. на кипящей водяной бане. После охлаждения проб объем доводили до 3 мл и измеряли на спектрофотометре Agilent Technologies Cary-60 при длине волны 535 нм. Количество образовавшегося МДА определяли, пользуясь значением коэффициента молярной экстинции (1,56×10^-5 М-1/см-1). Концентрацию МДА выражали в нмоль МДА на мг белка.

Результаты и обсуждение

Как показали результаты первого эксперимента (табл. 1), уже после однократного введения всех исследуемых препаратов наблюдается влияние на проницаемость капилляров, что статистически значимо замедляет время выхода красителя в воспаленный участок по сравнению с контрольными данными. При этом эффективность капилляропротекторного действия повышается в ряду: ГК< Рутин <МАСГК< М/Р< Г/Р, а время выхода увеличивается от 1,5 до 3 раз относительно контрольных 6 минут, составляя от 8 до 16 минут.

Таблица 1.

Оценка капилляропротекторного действия исследуемых препаратов по времени выхода трипановой сини в очаг воспаления, M± m, n=3

Следует отметить, что при одинаковой дозе введения супрамолекулярные комплексы оказались более эффективны, чем сам рутин, время выхода трипанового синего увеличивается с 9,57±0,50 до 11,33±0,33 для М/Р и статистически значимо до 15,67±0,52 для Г/Р (p<0,005), а также значимо эффективнее своих тритерпеновых носителей: Г/Р против ГК - p<0,005, М/Р против МАСГК - p<0,05. При сравнении же активности двух комплексов комплекс Г/Р показал в 1,4 раза бόльшую капилляропротекторную эффективность, чем М/Р (p<0,01).

Похожая картина наблюдается при изучении препаратов как антиоксидантных средств: для всех препаратов показано уменьшение уровня МДА, как показателя перекисного окисления липидов, по сравнению с контролем, при этом свойства увеличиваются в ряду: МАСГК<М/Р< ГК< Рутин < Г/Р: уровень МДА снижается с 3,433±0,085 нмоль/мг в контроле до 3,113±0,129 нмоль/мг при введении М/Р (р>0,05) и далее значимо до 3,052±0,099 нмоль/мг при введении ГК (р<0,01), до 2,614±0,184 нмоль/мг при введении рутина (р<0,001)  и до 2,185± 0,164 нмоль/мг при введении Г/Р (р<0,000001).

Таблица 2.

Оценка антиоксидантных свойств исследуемых препаратов, M± m, n=9

Антиоксидантные свойства рутина оказались значимо (р<0,05) выше таковых тритерпеновых гликозидов и даже комплекса М/Р. При сравнении же активности двух комплексов комплекс Г/Р показал в 1,4 раза большие антиоксидантные свойства, чем М/Р (p<0,01), как и в случае с капилляропротекторным действием.

Результаты наших исследований показали, что биологическая активность комплексов зависит от выбранного носителя, и в данном случае сама ГК оказалась более эффективным доставщиком рутина, чем ее моноаммониевая соль. В тоже время низкодозовый комплекс Г/Р проявил в обоих случаях большую активность чем сам рутин, что связано непосредственно со свойствами комплексов ГК увеличивать растворимость рутина,  способствовать его проникновение через мембрану, а также с синергическим действием двух препаратов. Все это, а также наличие «капсулы» из ГК, защищающей от быстрого метаболизма действующего препарата, позволяет снизить эффективную терапевтическую дозу рабочего препарата в несколько раз [7, с. 341-342; 9, с. 116]. Поэтому дальнейшие исследования биологической активности Г/Р возможно необходимо проводить при введении более низких доз комплекса: 2,5 и 5 мг/кг.

Таким образом, сравнительная активность двух супрамолекулярных комплексов ГК и МАСГК с рутином на моделях in vivo показали большую эффективность комплекса ГК с рутином. При одинаковой дозе введения супрамолекулярный комплекс Г/Р в молярном соотношении 4:1 оказался более эффективным по капилляропротекторным (р<0,05) и антиоксидантным свойствам, чем рутин. Дальнейшие исследования рекомендовано проводить именно с этим комплексом, при низких дозах введения.

Список литературы:

1. Caparica, R., Júlio, A., Araújo, M. E. M., Baby, A. R., Fonte, P., Costa, J. G., & Santos de Almeida, T. Anticancer Activity of Rutin and Its Combination with Ionic Liquids on Renal Cells. //Biomolecules. – 2020. – Т. 10. – №. 2. – С. 233.
2. Ganeshpurkar A., Saluja A. K. The pharmacological potential of rutin //Saudi pharmaceutical journal. – 2017. – Т. 25. – №. 2. – С. 149-164.
3. Jain K. K. Role of nanobiotechnology in drug delivery //Drug Delivery Systems. – Humana, New York, NY, 2020. – С. 55-73. С.55
4. Maione, F., Minosi, P., Di Giannuario, A., Raucci, F., Chini M.G., De Vita,S., Bifulco,G., Mascolo, N. and Pieretti, S. Long-Lasting Anti-Inflammatory and Antinociceptive Effects of Acute Ammonium Glycyrrhizinate Administration: Pharmacological, Biochemical and Docking Studies // Molecules. – 2019. - № 24(13). – р.2453-2458.
5. Pastorino G, Cornara L, Soares S, Rodrigues F, Oliveira MBPP. Liquorice (Glycyrrhiza glabra): A phytochemical and pharmacological review. Phytother Res. 2018 Dec;32(12):2323-2339.
6. Selyutina OY, Polyakov NE. Glycyrrhizic acid as a multifunctional drug carrier - From physicochemical properties to biomedical applications: A modern insight on the ancient drug // Int J Pharm. – 2019. - №559. – р. 271-279.
7. Stonik VA, Tolstikov GA. Natural products: Designing Russian medications. Her Russ Acad Sci. 2008;78(4):338-345.
8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с.
9. Толстикова Т. Г., Сорокина И. В., Брызгалов А. О., Лифшиц Г. И., Хвостов М. В. Использование подхода комплексообразования с глицирризиновой кислотой для создания новых кардиотропных средств // Биомедицина. 2006. №4. – с.115-116.
10. БАД Рутин Solgar, 500 мг, 250 таблеток, производство Solgar, URL: https://ru.iherb.com/pr/solgar-rutin-500-mg-250-tablets/8570 (дата обращения 17.07.20)
11. БАД Рутин Thompson, 500 мг, 60 таблеток, производство Thompson, URL: https://ru.iherb.com/pr/Thompson-Rutin-500-mg-60-Tablets/9463 (дата обращения 17.07.20)
12. Рутин // Реестр лекарственных средств России. URL: https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_4018.htm (дата обращения 17.07.20)