Получение клеточных линий, резистентных к цитостатическим препаратам

Вступление

Частота возникновения онкологических заболеваний неуклонно растет по всему миру. К сожалению, лечение, во многих случаях, является малоэффективным. Химиотерапия - одна из разновидностей воздействия на опухолевые клетки, основанная на применении химических препаратов. При проведении первичной химиотерапии, может происходить ремиссия заболевания. Однако, по истечении некоторого времени, клетки могут начать делиться вновь, образуя новые опухоли. Это связано с тем, что опухолевые клетки приобретают устойчивость к вводимому веществу. В связи с этим, проводят вторичную химиотерапию (и, если необходимо, последующие) с использованием комбинаций других препаратов.

По данным GLOBOCAN 2018, IARC (Международного Агентства по Исследованию Рака) Российская Федерация в 2018 году занимает 5-е место в мире по числу смертей онкологических больных [GLOBOCAN, 2018]. В Российской Федерации в 2017 году около 40% пациентов с онкологическими заболеваниями диагностировались на 3-4 стадиях развития патологии [Каприн, Старинский, 2018]. Эти стадии характеризуются метастатическим процессом. Метастазы в отдельных органах, в первую очередь костном мозге, тяжелее поддаются химиотерапевтическому воздействию, и, как следствие, могут явиться очагом зарождения резистентных клеток. Следовательно, для нашей страны, в условиях низкой эффективности ранней диагностики онкологических заболеваний, проблема резистентности стоит острее, чем для стран с активно действующими государственными программами по диагностике рака. На наш взгляд, проблема может быть решена несколькими подходами: а) введение ежегодных обязательных программ по диагностике заболевания у населения; б) создание платформы для поиска противоопухолевых препаратов, учитывающих генетические и функциональные характеристики опухолей у пациентов РФ. Если на осуществление первого подхода у нас уйдет десятилетие, то получение тщательно охарактеризованных резистентных клеточных линий и тестирование кандидатов в препараты на таких линиях, возможно уже в ближайшее время. Создание и изучение новых резистентных клеточных линий позволит глубже понимать механизмы устойчивости к химиотерапевтическим препаратам.

Образование резистентности клеточных линий сопряжено с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП) [Shen et al., 2014]. Эпителиально-мезенхимальный переход – это процесс, при котором эпителиальные клетки претерпевают морфологические изменения, связанные с переходом клеток к мезенхимальному типу строения. ЭМП, помимо участия в онтогенезе, также известен как патологический механизм, сопутствующий различным заболеваниям, включая воспаление, фиброзы и рак. Процесс ЭМП широко известен при образовании первичных и метастазирующих опухолей. Также ЭМП связан с образованием механизмов резистентности опухолевых клеток [Di Meo et al., 2009; Shen et.al., 2014].

В данной работе мы получили клеточные линии рака лёгких (A549), предстательной железы (PC3) и шейки матки (HeLa), резистентных к наиболее часто используемым цитостатическим препаратам (Цисплатин, Доцетаксел (Таксотер®). Морфологически было показано наличие мезенхимального типа строения клеток, что позволило предположить о проявлении эпителиально-мезенхимального перехода при обретении клетками состояния резистентности.

Материалы и методы

1. Материалы, используемые в работе

Клеточные линии A549, PC3 и HeLa были приобретены в компании «ATCC» (Роквилл, МД, США). Препарат «Цисплатин» приобретен в компании «Тева» (Петах-Тиква, Израиль), «Доцетаксел» в «Авентис Фарма» (Дагенхэм, Великобритания). Реагент МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолиум бромид) был приобретён в компании «Sigma-Aldrich» (Сент-Луис, США). FBS (Эмбриональная бычья сыворотка) была приобретена в компании «Life Technologies Corporation» (Гранд Айлэнд, Нью-Йорк, США). Среда RPMI-1640 и антибиотики «Пенициллин/стрептомицин» 100х, были приобретены в компании «Панэко» (Москва, Россия).

2. Культивирование клеточных линий и получение резистентности

Клеточные линии A549, PC3 и HeLa культивировались в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 1х антибиотиков Пенициллин/Стрептомицин. Клеточные линии культивировались в СО₂-инкубаторе при температуре 37⁰С с 5% содержанием CO₂.

Клеточные линии обрабатывали соответствующими препаратами с увеличением концентрации: A549/Docetaxel (от 0,25 нмоль/л до 20 нмоль/л), PC3/Docetaxel (от 0,25 нмоль/л до 20 нмоль/л), Hela/CisPt (от 0,65 мкмоль/л до 26 мкмоль/л). Препараты добавлялись по достижении культурой 70% конфлюэнтности. Клеточные линии культивировались от 2 до 4 дней на каждой концентрации, с последующим пересевом. Для поддержания резистентного фенотипа добавляли концентрации препаратов: A549/Docetaxel - 20 нмоль/л, PC3/Docetaxel - 20 нмоль/л, Hela/CisPt – 26 мкмоль/л.

3. Оценка цитотоксичности препаратов

Для оценки чувствительности клеточных линий A549/Docetaxel (20 нмоль/л), PC3/Docetaxel (20 нмоль/л) и Hela/CisPt (26 мкмоль/л) к соответствующим препаратам, применяли МТТ-тест. Клеточные линии инкубировали, по достижении клетками 80-90% конфлюэнтности, их количество считали в камере Горяева. Клеточную суспензию разводили красителем Трипановым синим («Sigma Aldrich», США) в соотношении 1:1. Далее, клетки засевали в 96-луночные планшеты в количестве 2*10⁴ клеток на 1 лунку. Далее клеточные линии инкубировали в течение 24 часов перед добавлением соответствующего препарата в линейно-возрастающих концентрациях. Клеточные линии без добавления препарата служили в качестве контроля. На 72 час культивирования аспиратором убирали среду и к клеткам добавляли 10 мкл (5 мг/1 мл PBS) реагента МТТ и 90 мкл свежей среды. Клетки инкубировали 3 часа при 37⁰С. Содержимое лунок аспирировали, образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл DMSO. Светопоглощение измеряли на планшетном спектрофотометре Infinite M200 Pro («Tecan», Швейцария) при λ=555 нм, используя длину волны λ=650 нм в качестве референсной [Mossman, 1983]. Далее оценивали IC₅₀ обработанных и необработанных препаратом клеток. Индекс резистентности (RI) считали, как отношение IC₅₀ клеточной линии, обработанной препаратом, к IC₅₀ необработанной клеточной линии.

4. Отслеживание кривых роста исходных и резистентных клеточных линий

Исходные и резистентные клеточные линии собирали, считали в камере Горяева и рассевали в 96-луночные планшеты в количестве 1х10³ клеток на лунку. Каждый день, начиная со второго до пятого дня, для оценки пролиферации с помощью МТТ-теста, использовали отдельный 96-лучночный планшет.

5. Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводили в программе Microsoft Excel, пакета программ Microsoft Office 2013. Данные представляли в виде средних значений ± стандартное отклонение. Статистическую значимость оценивали используя t-критерий Стьюдента; значения p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты исследования

Цисплатин- и Доцетаксел-резистентные клеточные линии были получены пошаговым добавлением концентраций препаратов в течение 4 месяцев. Начальная концентрация составляла 5% от IC_50. Последующие концентрации подбирались произвольно (первые 5 концентраций не превышали 10% от IC₅₀). Таким образом, мы получили клеточные линии A549/Docetaxel, PC3/Docetaxel и HeLa/Cis-Pt, с индексом резистентности 18, 17 и 4,6 соответственно (таблица 1).

Таблица 1.

Значения IC₅₀ исходных и резистентных клеточных линий

Мы провели эксперименты по определению пролиферации клеточных линий. Проводили сравнительный анализ кривых роста исходной и соответствующей резистентной клеточной линии.

Рисунок 1. Кривые роста исходной клеточной линии A549 и линии A549/Doc/20nM, обладающей резистентностью к Доцетакселу

Как видно из Рисунка 1, клеточная линия A549/Doc/20nM, обладающая резистентностью к Доцетакселу, на 4-5 день роста имеет меньшее время удвоения, что свидетельствует о замедленных пролиферативных свойствах данной резистентной клеточной линии.

Рисунок 2. Кривые роста исходной клеточной линии PC3 и линии PC3/Doc/20nM, обладающей резистентностью к Доцетакселу

Как видно из Рисунка 2, клеточная линия PC3/Doc/20nM, обладающая резистентностью к Доцетакселу, на 4-5 день роста имеет меньшее время удвоения, что также свидетельствует о замедленных пролиферативных свойствах данной резистентной клеточной линии.

Рисунок 3. Кривые роста исходной клеточной линии HeLa и линии HeLa/CisPt/26uM, обладающей резистентностью к Цисплатину

Как видно из Рисунка 3, клеточная линия HeLa обладает большей пролиферацией, чем линии A549 и PC3. Клетки HeLa, обладающие резистентностью к химиотерапевтическому препарату Цисплатину, также имеют меньшее время удвоения, что свидетельствует о замедленных пролиферативных свойствах, данных резистентных клеточных линий.

Таким образом, мы показали, что полученные нами резистентные клеточные линии имеют меньшую скорость пролиферации по сравнению с исходными раковыми клетками, что подтверждает наличие резистентности у новых клеточных линий [McDermott et al., ‎2014].

Мы провели анализ клеток с помощью световой микроскопии. Во всех резистентных клеточных линиях наблюдалось изменение морфологии: от эпителиальных клеток с одинаковой формой и пограничным расположением друг к другу, клетки перешли к «мезенхимальному» типу строения – появилась разрозненность форм и образовалось расстояние между клетками (рисунок 4).

Рисунок 4. Образование мезенхимального типа морфологии клеток на примере HeLa/Cis-Pt/26uM клеточной линии

Данные наблюдения позволяют предположить о проявлении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). По данным литературы, ЭМП ассоциирован с образованием механизмов резистентности [DiMeo et al., 2009].

Обсуждение

На сегодняшний день одной из важнейших проблем неблагоприятного исхода терапии онкологических заболеваний является хеморезистентность раковых клеток. Ранее было показано, что клеточный фенотип имеет взаимосвязь с феноменом резистентности [Maseki et al., 2012]. Клетки с мезенхимальным типом строения являются более устойчивыми к химиотерапии, чем клетки с эпителиальным типом.

В Российской Федерации отсутствует платформа тщательно охарактеризованных резистентных клеточных линий, с помощью которой возможно будет искать новые противоопухолевые препараты, учитывая генетические особенности опухолей каждого конкретного пациента. В данной работе мы получили резистентные клеточные линии рака лёгких (A549), предстательной железы (PC3) и шейки матки (HeLa) с различными индексами резистентности к цитостатическим препаратам (Цисплатин, Доцетаксел (Таксотер®)). Мы показали основные характеристики клеток, такие как скорость пролиферации и анализ морфологии, указывающий на изменение типа строения клеток с эпителиального на мезенхимальный, что соответствует образованию устойчивости к препаратам.

Благодарности

Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.