Активность глутатионтрансферазы и цитозром Р450 редуктазы у больных с опухолями молочной железы

Согласно статистическим данным ВОЗ возникновению опухолей молочной железы способствуют многие негативные факторы: загрязнение окружающей среды химическими веществами, пестицидами, облучение, повышенное содержание эстрогенов в организме женщины, мутации генов и др. [1, с. 95-96; 4, с. 95-96). Отмечено, что в развитых странах доброкачественные опухоли молочной железы возникают чаще, чем злокачественные. Согласно сведениям онкологов Отделения Маммологии Онкологического Института Молдовы, количество больных с опухолями молочной железы за последнее десятилетие увеличилось [13, с.181].

Хорошо известно, что развитие рака молочной железы обусловлено изменением генома клетки под воздействием внешних неблагоприятных факторов и гормонов-эстрогенов [1, с. 371; 13, c. 182). Показано, что после мутации BRCA гена возрастает риск развития рака молочной железы в 80% случаев. Канцерогенные вещества воздействуют на ДНК клеток молочной железы, образуя химические связи. Следствием этого является повреждение участков генома, содержащих BRCA1 и BRCA2 гены. Мутации были обнаружены также в ATM, TP53, PTEN и других генах [1, с. 372].

В процессе роста опухоли молочной железы происходят существенные изменения метаболизма, понижается иммунитет, увеличивается интоксикация организма. Большую роль в защите организма от эндотоксинов и экзотоксинов играют два фермента: глутатионтрансфераза и НАДФ-зависимая цитохром Р450 редуктаза. Глутатионтрансфераза катализирует реакции конъюгации токсических веществ с восстановленным глутатионом. Благодаря её действиям образуются нетоксичные конъюгаты, которые выводятся из организма. Довольно часто у онкологических больных, принимающих химиотерапию, развивается лекарственная устойчивость клеток опухоли к препарату. Принимая это во внимание, поиск препаратов, ингибирующих активность глутатионтрансферазы, является актуальной задачей. НАДФ-зависимая цитохром Р450 редуктаза также выполняет антитоксическую функцию, восстанавливая токсины в безвредные уже для организма вещества. Фермент вовлечён в обмен стероидов в качестве субстратов. Поэтому, его можно рассматривать в качестве биомаркёра опухолей молочной железы [9, с. 205-206]. Катализируя гидроксилирование повышенное содержание в организме женщины эстрадиола, он генерирует образование свободных радикалов, способствующих перекисному окислению липидов клеточных мембран и вызывающих повреждения клеток, что ведёт к патологии [3, с. 321].

Цель исследования: Проведение сравнительного анализа активностей глутатионтрансферазы и НАДФ-зависимой цитозром Р450 редуктазы в тканях опухолей и здоровых тканях молочной железы.

Материал и методы исследования

Исследование было проведено в Отделении Маммологии Онкологического Института Молдовы. Все исследования были проведены согласно правилам этики. На основании установленного диагноза 57 пациентов с опухолями молочной железы были распределены на 2 группы: 1- 23 пациента с раком молочной железы (РМЖ); 2- 34 пациента с доброкачественными опухолями (ДМЖ: аденома, фиброаденома). Биоматериал опухолей молочной железы (~1г) был взят во время операции по удалению опухоли и сразу же заморожен. В качестве контроля использовали биоматериал здоровой ткани этой же молочной железы. Для получения гомогенатов биоматериал размораживали и гомогенизировали в гомогенизаторе типа Поттера (тефлон-стекло) в растворе 0,25 М сахарозы с 2 мМ ЭДТА и 25 мМ Трис-HCl, рН 7,4. Затем гомогенаты инкубировали 30 минут с раствором тритон Х-100 (1% конечная концентрация). После этого гомогенаты центрифугировали с охлаждением (+4^оС) при 8 000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочные жидкости использовали для определения активности ферментов на спектрофотомере “Humalyzer 2000”. Активность глутатионтрансферазы (ГТ) определяли по методу Habig W. и соавт. [5, c. 7132]; активность НАДФ-зависимой цитохром Р450 редуктазы (Цит Р450 Ред) – по методу Archakov A. и соавт. [2, c.1056]. Для расчёта удельной активности ферментов (МЕ/г белка) определяли в исследуемых пробах содержание белка по методу Лоури [7, c. 265]. Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента с использованием пакета прикладных программ Microstat: Microsoft Excel 2007.

Результаты исследования и их обсуждение

Глутатионтрансфераза (ГТ). На рисунке 1 представлены результаты определения активности ГТ в тканях доброкачественной опухоли молочной железы (ДМЖ) и рака молочной железы (РМЖ). Активность ГТ у больных

Рисунок 1. Активность ГТ в опухолях молочной железы больных

ДМЖ в ткани опухоли составляла 117,9% (p>0,05) от активности фермента в здоровой ткани этой же молочной железы (контроль). У больных РМЖ активность ГТ в опухоли была равной 94,3%, то есть немного ниже, чем активность в здоровой ткани (p>0,05).

Ранее нами были получены результаты исследования активности ГТ в сыворотке крови больных ДМЖ и РМЖ [12, с. 62]. Было найдено, что активность ГТ в сыворотке крови больных ДМЖ была выше в 1,4 раз (МЕ/л) активности фермента в сыворотке крови здоровых женщин (контроль). Активность ГТ в сыворотке крови больных РМЖ, напротив, была на 15% (МЕ/л) ниже, чем активность фермента в сыворотке здоровых. Удельная активность ГТ (МЕ/г белка) у больных ДМЖ была повышена в 5,9 раз (p<0,01), а у больных РМЖ – в 2,4 раза (p<0,01). Такую же тенденцию активности мы наблюдали и в ткани опухолей (Рис. 1). В этом же нашем раннем исследовании (2016) мы определяли содержание восстановленного глутатиона в сыворотке крови. Его содержание в сыворотке больных РМЖ было почти в 2 раза ниже, чем в сыворотке больных ДМЖ. Возможно, пониженное содержание глутатиона, необходимого для реакций коньюгации ГТ, поясняет низкий уровень активности фермента у больных РМЖ, как в сыворотке крови, так и в опухоли.

Nguyen T.P. и соавт. (2009) получили результаты, подтверждающие индукцию активности ГТ на генетическом уровне, в чём большая роль принадлежит глутатиону [10, с. 13293]. Kauvar T.P. и соавт. (1996) в своих исследованиях показали, что с развитием опухоли возрастает и роль ГТ, поэтому, в ДМЖ её активность повышается [6, с. 191-192]. Masella R. и соавт. (2005) считают, что полиморфизм ГТМ1 способствует возникновению РМЖ, поэтому, активность ГТ в ткани РМЖ понижена [8, с. 584].

НАДФ-зависимая цитохром Р450 редуктаза (ЦитР450Ред). Результаты определения активности фермента, представленные на рисунке 2, демонстрируют картину, «зеркально отличную» от активности ГТ. В ткани ДМЖ активность фермента была существенно ниже контрольных значений, составляя 71% (p<0,05), а в ткани РМЖ активность ЦитР450Ред была выше (135,9%; p<0,05) значений активности фермента в здоровой ткани молочной железы.

Murray G.I. и соавт. (2010) изучали полиморфизм ЦитР450 в ткани РМЖ [9, с. 205-206]. Они наблюдали корреляцию между повышением активности фермента и ростом опухоли. На основании полученных результатов исследователи пришли к выводу, что ЦитР450 является маркёром РМЖ.

Рисунок 2. Активность цитохром Р450 редуктазы в опухолях больных

Vaclavicova R. и соавт. (2007) исследовали роль ЦитР450 у больных РМЖ и взаимосвязь активности фермента с экспрессией генов ЦитР450. Также они изучали роль фермента в метаболизме противоопухолевых лекарств. Было выявлено, что особую роль играет ген CYP2E1, экспрессия которого повышает роль фермента как прогностического маркёра РМЖ. Экспрессия другого CYP1B1 гена повышает синтез фермента, который ответственен за метаболизм канцерогенов, поступающих в организм [11, с. 4446-4448].

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что ферменты ГТ и ЦитР450Ред являются биомаркёрами, отражающими состояние и прогноз опухолей молочной железы, ДМЖ и РМЖ. Определение активности этих ферментов можно рассматривать как дополнительный биохимический тест при дифференциальной диагностике опухолей молочной железы.