Альфа-синуклеин как биомаркер в дофаминергических нейронах нигростриатной системы мозга при болезни паркинсона

АННОТАЦИЯ

Болезнь Паркинсона (БП) – медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, основным элементом патогенеза которого является гибель дофаминергических (ДА-ергических) нейронов нигростриатной системы. Тела ДА-ергических нейронов локализованы в черной субстанции (ЧС), а их аксоны проецируются в стриатум. БП длительное время протекает бессимптомно. Появление специфических моторных симптомов свидетельствует о пороговой деградации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и истощении компенсаторных резервов мозга. Ранняя диагностика, а значит и превентивная терапия, невозможны после перехода заболевания в клиническую стадию. Это ставит вопрос о необходимости разработки ранней диагностики и определения группы риска БП задолго до появления специфических симптомов. Единственным путем изучения БП на ранних стадиях может стать моделирование заболевания на животных и изучение специфических маркеров.

ABSTRACT

Parkinson's disease (PD) is a progressive long-term neurodegenerative disorder. The key component of the pathogenesis of PD is the death of dopaminergic (DA-ergic) neurons of nigrostriatal system. The somas of DA-ergic neurons lie in substantia nigra (SN) and axons are projected to striatum. PD for a long time is asymptomatic. When the level of degeneration of dopamine neurons transcends the threshold and exhaustion of compensatory allowance of the brain, the first motor symptoms appear. Early diagnosis, and therefore preventive therapy, is impossible after the transition of PD to the clinical stage. This raises the question about necessity of development of early diagnostics and determination of group risk of  PD before the appearance of specific symptoms. The only possible way to study it and its specific markers is experimental modeling of early stages of PD on animals.

Введение. ДА-ергическая нигростриатная система мозга является ключевым звеном регуляции двигательной функции млекопитающих. Ее деградация у человека приводит к развитию одного из самых социально тяжелых и распространенных нейродегенеративных заболеваний – БП [9,10]. Особенностью БП является то, что специфические моторные симптомы, а следовательно, и возможность диагностирования, появляются через 25-30 лет после начала патологического процесса при гибели большей части ДА-ергических нейронов и снижении уровня синтеза ДА в стриатуме на 70-80% [4–7, 12]. В связи со значительной потерей мишеней для фармакотерапии эффективность лечения крайне низкая. Отсюда очевидна необходимость выявлять БП на доклинической стадии, что позволит максимально продлить комфортную жизнь пациентов. В качестве одного из основных маркеров доклинической стадии БП рассматривается неструктурированный гомотетрамерный белок α-синуклеин с преимущественно пресинаптической локализацией в нейронах [11]. Образование телец Леви в нейронах происходит из-за нарушения метаболизма данного белка: перехода из мономерной и олигомерной форм  в фибриллярную, которая является токсичной для клетки, с последующей агрегацией фибрилл в конгломераты – тельца Леви [8].

Цель: выявление α-синуклеина в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы мозга для дальнейшего анализа содержания белка на хронических моделях доклинической и ранней клинической стадиях БП у мышей. Задачи: а) подбор протокола использования коммерческих антител (АТ) к α-синуклеину и оценка его специфичности на фиксированной нервной ткани; б) оценка колокализации α-синуклеина и тирозингидроксилазы (ТГ), скорость-лимитирующего фермента синтеза дофамина, в нигростриатной системе.

Объект и методы. Хронические модели доклинической и ранней клинической стадий БП на мышах были разработаны ранее [2,3]. Для этого использовали мышей линии C57Bl/6 (самцы) в возрасте 2,5-3 месяца из питомника «Пущино», содержащихся при режиме 12/12 (день/ночь), при свободном доступе к воде и еде. Работа с животными осуществлялась по протоколу, утвержденным комитетом по биоэтике учреждения, находящимся в соответствии с национальными и международными конвекциями и положениями. Через неделю после последнего введения токсина для создания хронической модели БП животных наркотизировали изофлураном, декапитировали. Извлеченный мозг по описанной ранее схеме [3] помещали в фиксатор на разное количество часов при разной температуре (в зависимости от составленного протокола), затем промывали трижды в 0.02 М фосфатно-солевом буфере, помещали в 20% сахарозу на 48 ч, замораживали в гексане при –40°C и хранили при –70°C.  Подбор протокола и оценку специфичности коммерческих АТ к α-синуклеину (Millipore, США) проводили на смонтированных на криостате и вибратоме (оба Leica, Германия)  фронтальных срезах стриатума и ЧС интактных животных. Толщина срезов стриатума – 12 мкм, ЧС – 20 мкм. Использованы различные фиксаторы (4% парафармальдегид (ПАФ) с 0,4% пикриновой кислотой и без нее), разное время постфиксации (4, 6,12 и 24 ч), а также несколько разведений АТ1 – 1:200, 1:500, 1:2000, 1:5000, 1:6000, 1:8000; АТ2 (Goat, Invitrogen; Goat, Sigma) – 1:200 и 1:500. Время экспозиции с АТ1 выбиралось от 20 ч до 40 ч в зависимости от температуры (4°С или 20°С), с АТ2 – 2 ч. В качестве отрицательного контроля брали фронтальные срезы ЧС и стриатума нокаутных мышей по гену SNCA и SNCB, любезно предоставленные научным центром ФАВ (Черноголовка).

Результаты. Были выявлены α-синуклеин-иммунореактивные (α-синуклеин-ИР) аксоны в стриатуме на фронтальных криостатных (Рис.1) и вибратомных (Рис. 2) срезах мозга. При этом на фронтальных срезах ЧС α-синуклеин-ИР тел нейронов обнаружено не было, также как в стриатуме и ЧС в отрицательных контролях. Отсутствие α-синуклеин-ИР тел нейронов в ЧС у интактных животных хорошо согласуется с имеющимися в литературе данными, согласно которым он был выявлен методом иммуногистохимии при моделировании паркинсонизма у мышей, но отсутствовал у контрольных животных.

Рисунок 1. Иммунореактивность на альфа-синуклеин у нокаутных по гену SNCA (TG) и мышей дикого типа (WT). АТ1 1:5000, ув. х 63, без пикриновой кислоты. Контроль (А). Время постфиксации: 4 ч (B), 6 ч (C), 12 ч (D), 24 ч (E). С пикриновой кислотой, постфиксация 6 ч (F).

Рисунок 2. Иммунореактивность на альфа-синуклеин у нокаутных по гену SNCA (TG) и мышей дикого типа (WT). АТ1 1:5000, ув. х 63, с пикриновой кислотой. Контроль (А) и опыт (B), время постфиксации 6 ч.

Для определения колокализации α-синуклеина и ТГ, использовали фронтальные срезы ЧС и стриатума. ТГ выявляли с помощью АТ, предоставленных профессором Ж. Тибо (Франция). В качестве контроля использовали ядро шва. Было показано частичное перекрывание α-синуклеина и ТГ в стриатуме, в то время как в ЧС были выявлены только ТГ-ИР тела нейронов. В ядре шва α-синуклеин-ИР и ТГ-ИР не обнаружены (данные не представлены).

Таким образом, протокол использования коммерческих АТ отработан, выполнена оценка их специфичности, а также колокализации α-синуклеина и ТГ в стриатуме.

Перспективы и обсуждение. В дальнейшей работе планируется провести сравнительный полуколичественный анализ содержания α-синуклеина в стриатуме и в ЧС на доклинической и ранней клинической стадиях БП у мышей. Согласно литературным данным, ИР α-синуклеина в телах нейронов показана только после введения МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, специфический токсин ДА-ергических нейронов), с помощью которого моделируют БП у животных [8]. На данных моделях планируется провести анализ наличия  структур, похожих на тельца Леви, в ДА-ергических нейронах, а также дать характеристику изменений модифицированных форм α-синуклеина (фосфорилированного, нитрированного), которые либо способствуют агрегации, либо, наоборот, замедляют этот процесс. 

Для перекрестного изучения аналогичного процесса у человека на доклинической стадии БП также необходимо «подобрать» подходящую модель пациентов для исследований. Не плохой, затрудненной с этической стороны, перспективой видится включение в когорту для исследований пациентов, получающих медикаментозную терапию в специализированных, например, психиатрических стационарах. Объясняется это тем, что ряд лекарственных препаратов, как то: нейролептики; антагонисты (блокаторы) ДА-рецепторов (метоклопрамид, дипразин, циннаризин, флунаризин); препараты, снижающие кругооборот ДА в синапсах (α-метилдофа); центральные симпатолитики, истощающие запасы ДА в нервных терминалях (резерпин, тетрабеназин); серотонинергические средства (флуоксетин или другие ингибиторы обратного захвата серотонина), тормозящие активность ДА-ергических нейронов ЧС – используются чаще всего в психиатрической практике и, как следствие, у пациентов профильных стационаров чаще наблюдается БП [1]. Получив информированное согласие законных представителей, отбирая пробы крови этих пациентов, мы сможем с определенной, рассчитанной математически, долей вероятности и достоверности определить и очертить круг биомаркеров в крови потенциальных носителей доклинической стадии БП.