ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ РИТУКСИМАБА НА РЕЗУЛЬТАТЫ ПЕРЕКРЕСТНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧЕК: ОБЗОР

АННОТАЦИЯ

Ритуксимаб – химерное моноклональное антитело, блокирующее пролиферацию В-клеток. Используется преимущественно в гематологической практике, для лечения аутоиммунных и неврологических заболеваний. В настоящее время применяется в качестве десенсибилизирующей терапии при отторжении органов и для проведения АВО-несовместимой трансплантации.  Однако исследований по изучению влияния ритуксимаба на перекрестную совместимость в Казахстане не проводилось.

В статье описывается влияние ритуксимаба на результаты перекрестной совместимости. Приведены результаты зарубежных исследований о методах, исключающих получение ложноположительных результатов, путем обработки сывороток моноклональными антителами против рикуксимаба.

ABSTRACT

Rituximab is a chimeric monoclonal antibody that blocks the proliferation of B- cells. It is used mainly in hematological practice, for the treatment of autoimmune and neurological diseases. Currently, it is used as a desensitizing therapy for organ rejection and for ABO-incompatible transplantation. However, no studies have been conducted on the effect of rituximab on crossmatch in Kazakhstan.

The article describes the effect of rituximab on crossmatch results. Results of foreign studies on methods excluding obtaining false-positive results by treatment of sera with monoclonal antibodies against rituximab are given.

Ключевые слова: ритуксимаб, перекрестная совместимость, проточная цитометрия, трансплантация, В-клетки, Т-клетки, донор-специфические антитела.

Keywords: rituximab, crossmatch, flow cytometry, transplantation, B-cells, T-cells, donor-specific antibodies.

Введение

Более 40 лет комплемент-зависимая цитотоксичность перекрестной совместимости (CDC-XM) является стандартным методом предтрансплантационных исследований. Положительная CDC-XM указывает на наличие донор-специфических антител (DSA) и считается противопоказанием к трансплантации почки [1]. Так, в 1960 году Terasaki P.I. впервые представил стандартный метод обнаружения донор-специфических HLA-антител на основе клеточной комплемент-зависимой цитотоксичности [2]. Уже в 1969 году Patel R. и Terasaki P.I. опубликовали данные исследования, в котором у 24 из 30 положительных кросс-матча отмечено отторжение органа по сравнению с отрицательным кросс-матчем, вышедшим у 8 из 195 кросс-матчей. Авторы объясняют это тем, что в большинстве случаев отторжение было среди пациентов с более высоким уровнем антител, это повторнородящие женщины и пациенты, имеющие в анамнезе трансплантацию [3,5]. Данное исследование показало необходимость проведения перекрестной совместимости на постоянной основе при трансплантации почек.

Своевременное обнаружение предварительно сформированных DSA с помощью перекрестного сопоставления комплемент-зависимой цитотоксичности, перекрестного сопоставления проточной цитометрии и твердофазного анализа залог успешной трансплантации почек [4].

За последние два десятилетия появились новые методы исследования, такие как проточная цитометрия (FCXM), твердофазные методы, и, в частности, технология Luminex произвела революцию в этой области и улучшила обнаружение анти-HLA-антител. Совместное использование этих новых методов усовершенствовали анализ оценки иммунологического риска [2]. Каждый анализ имеет свои преимущества и недостатки, и они обсуждаются.

Один из них CDC-XM анализ, который проводится перед трансплантацией и определяет наличие в сыворотке реципиента комплементсвязывающие иммуноглобулины (Ig) M и IgG направленные против донорских лимфоцитов. Тест состоит из инкубации сыворотки реципиента с донорскими лимфоцитами. Добавляется кроличьи комплемент в качестве источника комплемента, и, если присутствуют HLA-антитела, происходит лизис клеток. Результат теста положительный при наличии антител, способных связываться с донорским антигеном и активировать каскад комплемента.  

Перекрестная совместимость CDC-XM имеет ряд технических ограничений. Анализ в значительной степени зависит от жизнеспособности донорских клеток. Чувствительность теста варьируется в зависимости от партии кроличьего комплемента. Для преодоления этих ограничений использовались различные методы: увеличение времени инкубации, применение техника промывки, метод аугментации антител к человеческому глобулину. Это дает возможность обнаружения анти-HLA-антител с низким титром и антител, не связывающих комплемент. Предварительная обработка сыворотки пациента дитиотреитолом разрушает дисульфидные связи из пентамера IgM, что дает возможность различать антитела IgG и IgM.

Перекрестная совместимость CDC-XM представляет собой реакцию между сывороткой пациента и донорскими лимфоцитами и ложноположительные результаты могут быть вызваны не-HLA-антителами. Кроме того, на этот тест могут влиять лекарства или основное заболевание пациента, при этом ложноположительные результаты обнаруживаются из-за наличия у пациента аутоантител. Ритуксимаб же может обнаруживаться в сыворотке крови больного более 3 месяцев с момента приема и как следствие, кросс-матч с B-клетками может давать ложноположительные результаты в течение этого периода. Однако CDC-XM остается значимым методом исследования для оценки иммунологических рисков до трансплантации.   

FCXM более чувствительный тест, чем тест на перекрестную совместимость CDC-XM. FCXM представляет собой клеточный метод, который включает инкубацию донорских клеток с сывороткой реципиента. В отличие от CDC-XM, в этом методе сигнал проточного цитометра считывается путем добавления антител, конъюгированных с флуорохромом, а не путем использования цитотоксического ответа. В некоторых лабораториях донорские лимфоциты предварительно обрабатывают проназой для удаления Fc-рецепторов и CD20 с поверхности В-клеток. Путем удаления рецептора Fc на поверхности В-клеток можно удалить фоновый шум, который может возникать из-за связывания не-HLA-антител, удаление CD20 может уменьшить влияние ритуксимаба на В-клетки.

Более того, проблема ложноположительных результатов, вызванных не-HLA-антителами, аутоантителами и ритуксимабом, имеет тенденцию сохраняться, что является недостатком.

Разработка технологии Luminex способствовала повышению чувствительности и специфичности обнаружения HLA-антител. В данной технологии используются полистироловые микросферы с прикрепленными очищенными белками HLA.

Панель-реактивных антител (PRA) представляет собой метод скрининга анти-HLA-антител, присутствующих в сыворотке реципиента, с использованием объединенной антигенной панели, состоящей из микросфер антигенов HLA I класса или II класса. Метод единичных антигенов Single Antigen (SAB) является наиболее чувствительным методом тестирования. Метод основан на использовании микросфер, покрытых очищенными рекомбинантными HLA-антигенами для определения антител. Так как каждая микросфера покрыта только одним аллельным антигеном HLA, это дает преимущество в возможности обнаружения DSA.

Покрытые антигеном микросферы инкубируют с сывороткой реципиента с последующим добавлением флуоресцентно-меченых античеловеческих IgG. Если анти-HLA-антитела присутствуют в сыворотке реципиента, они связываются с микросферами. Тест считывается на проточном цитометре и степень положительности выражается как сдвиг канала. Luminex SAB дает информацию о титре анти-HLA-антител через значения средней интенсивности флуоресценции (MFI), которые используются в качестве важной информации при оценке иммунологического риска перед трансплантацией. Luminex SAB может давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты из-за присутствия IgM или различных ингибирующих факторов в сыворотке реципиента. Однако эти ограничения можно преодолеть с помощью гипотонического диализа, тепловой инактивации или предварительной обработки дитиотреитолом или этилендиаминтетрауксусной кислотой.

При наличии высокого титра антител может возникать феномен прозоны, при котором разбавленная сыворотка дает более высокий MFI, чем неразбавленная сыворотка, которую можно устранить разбавлением. Высокий титр антител препятствует образованию комплекса антитело-антиген, что приводит к ложноотрицательному результату. В этом случае, разбавление сыворотки реципиента, позволит обнаружить антитела и увеличение значений MFI.

Поскольку анализ SAB может обнаруживать специфические антитела, можно рассчитать индекс PRA. PRA — это индекс, который оценивает фактическую степень сенсибилизации реципиента, отражая частоту встречаемости HLA-антигенов в популяции, и может быть чрезвычайно важным при оценке времени ожидания высокосенсибилизированных реципиентов, ожидающих посмертных доноров.

Преимущество анализ SAB в использовании для мониторинга DSA de novo, что обеспечивает надлежащее ведение пациентов в посттрансплантационном периоде.

Индивидуальная оценка иммунологического риска перед трансплантацией возможна при совместном использовании результатов ранее описанных анализов перекрестной совместимости CDC-XM, FCXM и SAB [4, 5].  

В нашем Центре (РГП на ПХВ «Научно-производственный центр трансфузиологии») в качестве скрининговых тестов для выявления наличия анти-HLA-антител в качестве оценки иммунологического риска используются перекрестная совместимость, скрининг HLA-антител и PRA, если скрининг-тест положительный, проводят анализ SAB для выявления DSA.

Основными причинами получения положительного результата перекрестной совместимости могут быть: аутоиммунные заболевания, присутствие HLA-антител, наличие в анамнезе реципиента десенсибилизирующей терапии ритуксимабом, антитимоцитарным глобулином или внутривенными иммуноглобулинами [6].

Важно знать, что при отсутствии донор-специфических антител положительный результат возможен как при постановке CDC-XM, так и FCXM. Ложноположительный результат CDC-XM возможен в связи с наличием антител к IgM, что может быть устранено обработкой сыворотки дитиотреитолом.  Однако причиной стойких ложноположительных результатов CDC-XM и FCXM может быть наличие у пациентов аутоиммунного заболевания. Применение ритуксимаба в качестве лечения также может повлиять на оба метода исследования перекрестной совместимости с В-клетками [5]. 

Однако исследований по изучению влияния ритуксимаба на перекрестную совместимость реципиентов и доноров почки в Казахстане не проводилось, в связи с чем представляется интересным изучить опыт исследований в ближнем и дальнем зарубежье, для дальнейшего определения их трансферта в отечественную практику.

Результаты и обсуждение

Ритуксимаб представляет собой рекомбинантные химерные моноклональные антитела к поверхностным рецепторам В-лимфоцитов - CD20. Механизм действия ритуксимаба направлен на подавление активности В-клеток [7, 8-11]. Выделяют три основных механизма действия ритуксимаба: антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, комплемент-опосредованную цитотоксичность, антителозависимый фагоцитоз [9, 12-14].

Ритуксимаб первоначально применялся для лечения неходжкинской лимфомы [11, 14], затем нашел широкое применение при аутоиммунных заболеваниях: ревматоидный артрит [12, 15], системная красная волчанка [16-18] и в неврологической практике [9]. Genberg H. (2006), Kahwaji J. (2009), Tomita Y. (2019), Lee H.R. (2021) описано успешное применении ритуксимаба в трансплантологии для снижения десенсибилизации, при АВО-несовместимой трансплантации и при ряде других состояний [10, 19-22]. Десенсибилизация имеет ряд преимуществ, однако наличие ритуксимаба в сыворотках при проведении перекрестной совместимости может изменить результаты, полученные как методом CDC-XM, так и FCXM на ложноположительный [23]. Ритуксимаб в дозе 375 мг/м² элиминирует циркулирующие В-клетки в течение 6–12 месяцев после цикла инфузий. В некоторой степени ритуксимаб может играть роль в элиминации В-клеток в присутствии анти-HLA-антител. Было обнаружено, что ингибирование выработки антител с помощью ритуксимаба снижает чувствительность пациентов с DSA. Совсем недавно его стали применять в качестве иммуномодулирующего средства при трансплантации почки и для десенсибилизации у пациентов с антитело-опосредованным отторжением [24].

Chauhan K. и  Mehta A. A. (2019) описывают исследование Jackson и соавторов (2015) о посттрансплантационном уровне HLA-антител у 25 реципиентов, десенсибилизированных с помощью индукции ритуксимабом, и у 25 без нее, определено влияние ритуксимаба на истощение В-клеток. Авторы обнаружили значительно меньшее восстановление HLA-антител у пациентов, получавших ритуксимаб (7% DSA и 33% не-DSA), по сравнению с контрольной группой, десенсибилизированной и трансплантированной без ритуксимаба (32% DSA и 55% не-DSA). Кроме того, величина увеличения была значительно выше среди пациентов, не получавших ритуксимаб. По сравнению с контрольной группой у пациентов, получавших ритуксимаб, наблюдалось значительно большее среднее снижение значения MFI DSA (2505 против 292), но схожая частота стойкости DSA (52% у получавших ритуксимаб и 40% у нелеченых реципиентов) [25].

Причина ложноположительного результата в FCXM фиксация человеческого анти-IgG к ритуксимабу, связанному с CD20 В-клеток. В случае CDC-XM положительная реакция обусловлена активацией классического пути комплемента ритуксимабом, при котором анти-CD20-антитело типа IgG связывается с клеточной поверхностью [23].

В работе Doss S.A. (2021), ретроспективно было проанализировано 28 пациентов, получавших ритуксимаб, с 30 донорскими лимфоцитами обработанными и необработанными проназой. В ходе исследования были получены ложноположительные результаты перекрестной совместимости с использованием Т-клеток, при отсутствии донор-специфических антител I класса. С В-клетками также были получены положительные результаты совместимости. Автором описывается обнаружение феномена «хвоста Т-клеток», который исчезает при обработке клеток донора проназой [26].

Lazar-Molnar E. et al. (2015) описали два клинических случая обнаружения ложноположительных результатов перекрестной совместимости с В-клетками, у пациентов ранее (7, 8 месяцев назад) получавших ритуксимаб в качестве лечения по поводу аутоиммунного заболевания. В описанных случаях положительная перекрестная совместимость В-клеток была вызвана остаточным содержанием ритуксимаба в сыворотке пациентов, что препятствовало проведению пересадки почки. Проведение обработки сывороток пациентов антителом к ритуксимабу и получение после этого отрицательного результата перекрестной совместимости, подтвердило влияние ритуксимаба на перекрестную совместимость [27].

Colmenero Velazquez А. (2020) протестировал использование моноклонального антитела, подавляющее действие ритуксимаба (10C5, Abnova), в качестве метода предотвращения ложноположительных результатов в FCXM и CDC-XM вызванных ритуксимабом. Данное исследование включало две группы: контрольную без HLA-антител и опытную, имеющую сильную сенсибилизацию к HLA антигенам II класса и получавшую посттрансплантационное десенсибилизирующее лечение почек с помощью плазмафереза ​​и ритуксимаба. Установлено, что образцы, не обработанные моноклональным антителом, показали положительный результат с B-клетками в обеих группах. В группе пациентов без HLA-антител II класса был получен отрицательный результат, что подтвердило результаты, полученные в необработанных сыворотках, результаты были ложноположительными. В сенсибилизированной группе перекрестная совместимость осталась положительная из-за действия DSA [23]. Аналогичные результаты были получены Malvezzi P. (2023) [28].

Desoutter J. (2016) описывает клинический случай, положительного результата перекрестной совместимости с В-клетками, связанный с недавней терапией донора ритуксимабом, что может быть причиной получения ложноположительного результата кросс-матча [6].

Alheim M. и соавторы (2018) в больнице Каролинского университета (Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden) при ABO-несовместимой трансплантации почки используют протокол кондиционирования основанный на удалении анти-A/B антител и истощении B-клеток с помощью ритуксимаба. В связи с получением ложноположительных результатов CDC-XM с В-клетками, донорские клетки обрабатывались высокими концентрациями (> 1 мг/мл) проназы. Однако, в настоящее время имеются данные о том, что проназа может повлиять на результаты FCXM. Авторы в исследовании оценили блокирование сыворотки двукратным моноклональным антителом анти-RIT (клон MB2A4). Блокирование анти-RIT не влияло на результаты перекрестной совместимости с Т-клетками. Применение в качестве блокирования ритуксимаба анти-RIT-антителом перед кросс-матчем обеспечило надежное обнаружение DSA без использования донорских клеток, обработанных проназой [29].

Заключение

Таким образом, проведенный литературный обзор свидетельствует о результативности использования ритуксимаба при проведении перекрестной совместимости, что позволяет определить ритуксимаб, как действенный инструмент, позволяющий с высокой эффективностью проводить трансплантацию донорского органа. Однако, для исключения получения ложноположительных результатов перекрестной совместимости требуется дальнейшее изучение, совершенствование и стандартизация протоколов исследования для пациентов получающих десенсибилизирующую терапию. Тем самым создастся потенциал для разработки новых методов исследования или совершенствования имеющихся.

Учет иммунологического анамнеза реципиента при интерпретации результатов HLA-исследований имеет решающее значение для получения максимального положительного клинического эффекта ритуксимаба.

Работа проведена в рамках научного проекта по грантовому финансированию Министерства образования и науки Республики Казахстан АР09260122.

Список литературы:

1. Chamsai S., Kittisares K., Thanaketpaisarn Y., Ngamthawornwong S., Koktathong K. Evaluation of the Three-Colored Flow Cytometric Crossmatch Assay in Living-Related Kidney Transplantation // J Hematol Transfus Med. 2018. Vol. 28. №. 3. Р.239–248.     
2. Jayant K., Isabella Reccia I., Bridson M. J., Sharma A., Halawa A. Role of crossmatch testing when Luminex-SAB is negative in renal transplantation // Polish Journal of Surgery. 2018. Vol. 90. № 1. Р.42–46.            
3. Patel R., Terasaki P.I. Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation // New England Journal of Medicine. 1969. Vol. 280. №. 14. Р.735–739.            
4. Park Y., Ko Jeong E., Ha Chung B., Woo Yang C. Kidney transplantation in highly sensitized recipients // Kidney Research and Clinical Practice.  2021. Vol. 40. № 3. Р.355–370.            
5. Mahowald G.K. The CDC crossmatch in the era of flow cytometric cross-match and single antigen beads // Jornal brasileiro de nefrologia. 2021. Vol. 43. №3. Р.299–300.               
6. Desoutter J., Apithy M.-J., Bartczak S., Guillaume N. False Positive B-Cells Crossmatch after Prior Rituximab Exposure of the Kidney Donor // Case Reports in Transplantation. 2016. Vol. 2016. Р.3.
7. Соловьев С. К. Ритуксимаб новые перспективы лечения больных СКВ // Научно-практическая ревматология. – 2008. – №1S. – С. 29–33.
8. Edwards J.C., Szczepanski L., Szechinski J, Filipowicz-Sosnowska A., Emery P., Close D.R., Stevens R.M., Shaw T. Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis // The New England journal of medicine. 2004.  Vol. 350. № 25. Р. 2572–2581.
9. Кушнир Я.Б., Терещенко Н.М., Абрамова М.П., Готовчиков А.А., Полушин А.Ю., Краснов В.С. Опыт применения ритуксимаба в неврологической практике (обзор литературы и собственное наблюдение) // Учёные записки Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова. – 2021. – Т.28. - №2. – С.17– 22. 
10. Genberg H., Hansson A., Wernerson A., Wennberg L., Tyden G. Pharmacodynamics of Rituximab in Kidney Allotransplantation // American Journal of Transplantation. 2006. Vol. 6. № 10. P.2418–2428.
11. Lioté H., Lioté F., Séroussi B., Mayaud C., Cadranel J. Rituximab-induced lung disease: a systematic literature review // European Respiratory Journal. 2010. Vol. 35. № 3. Р.681–687. 
12. Hanif N., Anwer F. Rituximab // StatPearls Publishing [Internet]. 2023. – Режим доступа: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK564374/ (дата обращения:19.06.2023).
13. Maloney D.G., Smith B., Rose A. Rituximab: mechanism of action and resistance // Seminars in oncology. 2002. Vol. 29. № 1. Supplement 2. Р.2–9.
14. Feugier P. A review of rituximab, the first anti-CD20 monoclonal antibody used in the treatment of B non-Hodgkin's lymphomas // Future Oncology. 2015. Vol. 11. № 9. Р.1327– 1342.
15. Hernández-Cruz B., García-Arias M., Ariza Ariza R., Martín Mola E. Rituximab in Rheumatoid Arthritis: A Systematic Review of Efficacy and Safety // Reumatologia Clinica. 2011. Vol. 7. № 5. P.314–322.  
16. Tanaka Y., Nakayamada S., Yamaoka K., Ohmura K., Yasuda S. Rituximab in the real-world treatment of lupus nephritis: A retrospective cohort study in Japan // Modern Rheumatology. 2023. Vol. 33. № 1. P. 145–153.   
17. Terrier B., Amoura Z., Ravaud P., et al. Safety and efficacy of rituximab in systemic lupus erythematosus: results from 136 patients from the French AutoImmunity and Rituximab registry // Arthritis and Rheumatology. 2010. Vol. 62. № 8. Р.2458–2466.   
18. Machado R.I., Scheinberg M.A., Queiroz M.Y., Brito D.C., Guimarães M.F., Giovelli R.A., Freire E.A. Use of rituximab as a treatment for systemic lupus erythematosus: retrospective review // Einstein (Sao Paulo). 2014. Vol. 12. № 1. Р.36-41.   
19. Kahwaji J., Tong C., Jordan S.C., Vo A. Rituximab: An emerging therapeutic agent for kidney transplantation // Transplant Research and Risk Management.  2009. Vol.1. P.15–29.   
20. Tomita Y., Iwadoh K., Ogawa Y., Miki K., Kato Y., et al. Single fixed low-dose rituximab as induction therapy suppresses de novo donor-specific anti-HLA antibody production in ABO compatible living kidney transplant recipients // PLOS ONE. 2019. Vol. 14. № 10. Р.1–15.
21. Lee H.R., Kim K., Lee S.W., Song J.H., Lee J.H., Hwang S.D. Effect of rituximab dose on induction therapy in ABO-incompatible living kidney transplantation: A network meta-analysis // Medicine. 2021. Vol. 100. № 10. Р.1–9.
22. Genberg H., Kumlien G., Wennberg L., Berg U., Tydén G.  ABO-Incompatible Kidney Transplantation Using Antigen-Specific Immunoadsorption and Rituximab: A 3-Year Follow-up // Transplantation. 2008. Vol. 85. № 12. Р.1745–1754.        
23. Colmenero Velazquez A., Iturrieta-Zuazo I., Valdivieso Shephard J.L., Di Natale M., Rita C., Ballester González R., Castañer Alabau J.L., Nieto Gañán I. Solutions to Avoid False Positives for Rituximab in Pre-Transplant Crossmatches // Antibodies. 2020. Vol. 9. № 3. Р.41.    
24. Wei X., Xie Y., Jiang R., Li H., Wu H., Zhang Y., Li L., Zhou S., Ma X., Tang Z., He J., Wu D., Wu X. The impact of Rituximab administered before transplantation in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: A real-world study // Frontiers in Immunology. 2022. Vol. 13. Article 967026. 
25. Chauhan K., Mehta A.A. Rituximab in kidney disease and transplant // Animal Models and Experimental Medicine. 2019. Vol. 2. № 2. P.76–82.          
26. Doss S.A., Mittal S., Daniel D.  Impact of rituximab on the T-cell flow cytometric crossmatch // Transplant Immunology. 2021. Vol. 64. Article 10136.         
27. Lazar-Molnar E., Hurst D., Pole A., Delgado J.C. Residual serum rituximab induces false positive flow cytometric B cell crossmatch more than 6months post-infusion // Human Immunology. 2015. Vol. 76. P.128.       
28. Malvezzi P., Senoussi O., Jouve T., De Palma C., Rostaing L., Bardy B., Masson D. Rituximab Interference in B-Cell Crossmatch: A Problem Solved // American Journal Transplantation.  2018 American Transplant Congress. (5 June 2018). 2017. Vol.17. Supplement 3.   
29. Alheim M., Wennberg L., Wikström A.-С. Pronase independent flow cytometry crossmatching of rituximab treated patients // Human Immunology. 2018. Vol. 79. № 2. P.132-135.