ОПТИМИЗАЦИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ГЛУБОКИХ ДЕФЕКТОВ МЯГКИХ ТКАНЕЙ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

АННОТАЦИЯ

В статье изложены результаты экспериментального применения созданной тканеинженерной конструкции из коровьего коллагена с добавлением аллофибробластов для оптимизации регенерации глубоких дефектов мягких тканей. Данные объективного исследования локального статуса мягких тканей и общего состояния экспериментальных животных свидетельствуют о положительном эффекте тканеинженерной конструкции для оптимизации заживления глубоких дефектов мягких тканей. Результаты морфологического исследования показали, что было определено что тканеинженерная конструкция на основе коллагена и аллофибробластов полностью резорбируется в течение 28 дней и не образуют фиброзную капсулу.

ABSTRACT

The article presents the results of experimental application of the created tissue-engineered structure from bovine collagen with the addition of allofibroblasts to optimize the regeneration of deep soft tissue defects. The data of an objective study of the local status of soft tissues and the general condition of experimental animals indicate a positive effect of tissue-engineered construction to optimize the healing of deep soft tissue defects. The results of the morphological study showed that it was determined that the tissue-engineered construct based on collagen and allofibroblasts was completely resorbed within 28 days and did not form a firosa capsule. 

Ключевые слова: регенеративная медицина, тканеинженерная конструкция, фибробласты, коллаген, заживление раны, дефект мягких тканей.

Keywords: regenerative medicine, tissue engineering construction, fibroblasts, collagen, wound healing, soft tissue defect.      

Актуальность. В последнее время, достаточно успешно развивается регенеративная медицина, направленная на восстановление пораженной болезнью или повреждённой (травмированной) ткани с помощью активации эндогенных стволовых клеток или с помощью трансплантации клеток (клеточной терапии)(Mahjour SB, Fu X, Yang X, et al., Lloyd C, Besse J, Boyce S.Lloyd C, Besse J, Boyce S.,2015).Одним из перспективных направлений регенеративной медицины является применение так называемых биоискусственных (тканеинженерных) конструкций (ТИК) (biomaterial-based tissue regeneration). Они состоят из следующих частей:

-клетки, способные формировать функционирующий внеклеточный матрикс;

-подходящий биодеградируемый носитель (матрикс) для трансплантации клеток;

-биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста), которые оказывают биостимулирующее действие на клетки поврежденной ткани [1, c.93].

Наиболее перспективным направлением развития технологий коррекции косметических дефектов является совместное использование аутологичных дермальных фибробластов с компонентами межклеточного матрикса. Исследования по разработке препарата, содержащего гиалуроновую кислоту и дермальные фибробласты человека, показали, что немедленный клинический эффект от использования коммерческих наполнителей можно успешно сочетать с долговременным эффектом от применения живых фибробластов (Wahl EA, Fierro FA, Peavy TR, et al.,2015, Мелешина А.В., Быстрова А.С., Роговая О.С., 2017). В мире имеется ряд производителей, выпускающих раневые покрытия на основе фибробластов промышленным путем, это TransCyte-аллогенные фибробласты неонатальной крайней плоти человека, связанных с кремниевой мембраной и выращенные на свином коллагене, покрывающем нейлоновую сетку [2, c.74, 3].

Цель исследования. Оценить эффективность созданной тканеинженерной конструкции на основе коллагена и клеток соединительной ткани для оптимизации регенерации глубоких дефектов мягких тканей.

Материалы и методы. Проведено доклиническое исследование эффективности тканеинженерной конструкции, полученной из коровьего коллагена с флавоноидами из Saphora japonica с добавлением аллофибробластов для оптимизации регенерации глубоких дефектов мягких тканей на спинках крыс.

Ранозаживляющая эффективность глубоких дефектов мягких тканей in vivo изучена на 12 половозрелых крысах-самцах. Для исследований крысы массой тела 164,83±1,608-173,33±2,32 гр были разделены на 2 групп по 6 особей в каждой группе.

В 1-ой экспериментальной группе для терапии глубокого дефекта мягких тканей применена тканеинженерная конструкция на основе коровьего коллагена с флавоноидами из Saphora japonica с добавлением аллофибробластов.

В 2-й контрольной группе глубокий дефект мягких тканей ушивали без применения ТИК.

Животные содержали в условиях вивария Межвузовской научно-исследовательской лаборатории (МНИЛ) ТМА на стандартном рационе с учетом положений международной конвенции о «Правилах работ с экспериментальными животными» (European Communities Council Directives of 24 November 1986, 86/609/EEC). После 2-х недельного карантина белые крыс были тщательно осмотрены, учитывался внешний вид, двигательная активность и реакция на рефлексы. Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария и находились на полноценном лабораторном пищевом рационе при свободном доступе к воде.

Для моделирования глубокого дефекта мягких тканей и изучения характера клинических проявлений в измененных тканях с применением фибробластов на различных носителях в эксперименте проводили анестезию (внутрибрюшинно вводили наркотическое вещество Этаминал натрия 1,6% в расчете 0,5 мл на 200 г массы тела животного).

Создание модели экспериментального глубокого дефекта мягкой ткани осуществляли путем проведения продольного разреза с помощью скальпеля в области спины параллельно позвоночному столбу после предварительного сбривания волос и обработки операционного поля бетадином длиной 3.0 см на глубину до фасции. Далее тупым путем рассекали фасцию, покрывающую мышцу. После обнажения мышцы, используя микрометр, выделяли 10 мм мышечной ткани и удаляли ее с целью создания дефекта. Затем в сформированный дефект помещали созданную тканеинженерную конструкцию (ТИК) с фибробластами (размер пленки составлял 10x10мм). Рану послойно ушивали.

Наблюдение проводилось в течение 1-х, 3-х, 7-х, 14-х и 21-х, 28 суток. Наблюдение за животными проводилось через каждые 4 часа в течении 28 дней. В ходе экспериментов оценивались локальный статус, общее состояние, потребление корма и воды, изменение массы тела (каждые 3 дня), особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, координация движений, реакция на внешние раздражители, частота и глубина дыхательных движений, состояние шерстного и кожного покрова, окраска слизистых оболочек, положение хвоста, количества и вид фекальных масс, регистрировались клинические признаки интоксикации:

Выведение животных из эксперимента осуществлялось передозировкой эфира. Патоморфологические исследования внутренних органов животных проводились по общепринятой методике. Кусочки тканей помещались в 10% формалиновый раствор, заливались в парафиновые блоки. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопическое исследование проводили с помощью светового микроскопа МИКМЕД-2 с встроенным фотоаппаратом с увеличением в 40, 100, 200 и 400 раз.

Клинико-лабораторные исследования периферической крови белых крыс и кроликов проводились на гематологическом анализаторе ВС-3000 (Mindray, P.R.China). По развернутому анализу крови изучены количество эритроцитов и лейкоцитов, Hb, цветной показатель, гемограмма с подсчетом ретикулоцитов, тромбоцитов, базофилов, эозинофилов, палочкоядерных лейкоцитов, сегментоядерных лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, СОЭ и др.

Биохимические показатели сыворотки крови определяли унифицированными методами: альбумин – бромкрезоловым; аспартат-аминотрансферазу (АСаТ) и аланинаминотрансферазу (АЛаТ) – унифицированным методом Райтмана-Франкеля; щелочную фосфатазу – унифицированным методом с нитрофенилфосфатом (наборы реактивов фирмы CYPRESS Diagnostics, Бельгия) на биохимическом анализаторе ВА-88 А (Mindray, P.R.China).

Статистические исследования проведены на основании стандартных клинических рекомендаций. Количественные данные представлены как среднее арифметическое (М) ± стандартное отклонение (SD) в случае нормального распределения и как медиана (Md) и квартили (Q)или (SD) при других распределениях. За статистически значимые изменения принимался уровень достоверности р<0,05.

Обработка результатов клинического обследования производилась на персональном компьютере Pentium-IVс использованием прикладных офисных программ MicrosoftExell и MicrosoftAccess, c расчетом среднеарифметической изучаемого показателя (M), ее стандартной ошибки (m), показателей достоверности (p) и критерия Стьюдента. При этом учитывались методики, существующие указания по статистической обработке данных в клинических и лабораторных исследованиях (Зайцев В.М. и др. 2003г.)

Результаты и их обсуждение. Для оценки медико-биологической безопасности и специфической активности апробированных тканеинженерной конструкции для оптимизации регенерации глубоких дефектов мягких тканей проведены гематологические и биохимические исследования периферической крови и сыворотки белых крыс.

В периферической крови изучена динамика содержания гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, эозинофилов, лимфоцитов, гематокрита, средней концентрации гемоглобина в эритроците, тромбоцитов в абсолютных числах, тромбокрита, абсолютного содержания лимфоцитов, абсолютного содержания смеси моноцитов, базофилов и эозинофилов, количества гранулоцитов (Табл. 1).

Таблица 1.

Результаты гематологических исследований периферической крови белых крыс (n = 2, M ± m).

Анализ полученных данных показал, что у опытных животных показатели  содержания гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, эозинофилов, лимфоцитов,  гранулоцитов, гематокрита, средней  концентрации  гемоглобина в эритроците, относительной ширины распределения эритроцитов, тромбоцитов в абсолютных числах, гетерогенности тромбоцитов, среднего объёма тромбоцитов, тромбокрита, абсолютного содержания лимфоцитов и смеси моноцитов, базофилов и эозонофилов, СОЭ находятся на одном уровне с контрольными значениями, т.е. гематологические показатели крови белых крыс на протяжение всего времени исследований не претерпевали статистически значимых отклонений (P > 0,05), как от нормы, так и по группам наблюдения.

Анализ результатов исследований динамики биохимических показателей сыворотки крови белых крыс, приведенных в табл.2, свидетельствует о том, что уровни аминотрансаминазных  ферментов (АЛТ, ACТ) и щелочной фосфатазы не выходят за рамки физиологической нормы и на одном уровне с контрольными значениями. Содержание гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТР), общего белка, альбумина, холестерина, глюкозы и общего билирубина не показали статистически достоверных различий (P > 0,05) на протяжение всего срока наблюдения, что подтверждает отсутствие токсического влияния.

Таким образом, результаты биохимических исследований сыворотки крови белых крыс на протяжение всего времени исследований не претерпевали статистически значимых отклонений по сравнению с контрольными и референсными значениями, что свидетельствует об эффективности (Табл.2.).  

Таблица 2.

Результаты биохимических исследований сыворотки крови белых крыс (n = 2, M ± m).

Результаты морфологического исследования. В первой группе, где применялась тканеинженерная конструкция на основе коллагена и аллофибробластов Выявлены единичные, фиброциты (одинарная стрелка), фибробласты (двойная стрелка) (рис.1,2).

В контрольной группе, где дефект мягких тканей заживал без применения тканеинженерной конструкции, мышцы с интерстициальным отёком в тонких прослойках соединительной и жировой ткани, отмечается некроз, лимфоидная инфильтрация и единичные фибробласты (рис.4). Сосуды расширенные. Кожа покрыта тонким слоем многослойного плоского ороговевающего эпителия, дерма отёчная с беспорядочно расположенными волосяными фолликулами и сальными железами. Выявлены очаги инфильтрации и некроза (рис.3).

Заключение. При проведении морфологического исследования глубокого дефекта мягких тканей при применении тканеинженерной конструкции (коллаген +аллофибробласты) было определено что они полностью резорбируются в течение 28 дней и не образуют фиброзную капсулу. Данные объективного исследования локального статуса кожи и мягких тканей и общего состояния экспериментальных животных свидетельствуют о положительном эффекте тканеинженерной  конструкции  из коллагена и аллофибробластов для оптимизации заживления глубоких дефектов мягких тканей.

Список литературы:

1. Севастьянов В.И.Технологии тканевой инженерии и регенеративной медицины //Регенеративная медицина и клеточные технологии–2014.- том XVI, № 3.-С 93-108
2. Храмова Н.В., Хусанова Ю.Б., Махмудов А.А. Эквиваленты кожи: за и против // Журнал стоматологии и краниофациальных исследований. - Ташкент, 2020. - №1(01). - С.72-75
3. Isabel Sánchez-Muñoz, Rosario Granados, Purificación Holguín Holgado, José Antonio García-Vela, Celia Casares, Miguel Casares. The use of adipose mesenchymal stem cells and human umbilical vascular endothelial cells on a fibrin matrix for endothelialized skin substitute. 2015 Jan;21(1-2):214-23.  [Электронный ресур].-Режим доступа: https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/ten.tea.2013.0626 (дата обращения: 17.07.21).