PHYLOGENETIC ANALYSIS AND TANNASE ACTIVITY OF Aspericullus oryzae AND Taloromyces albabiverticullus STRAINS ISOLATED FROM THE MICROBIOTA OF POMEGRANATE PEEL

УДК 579.222.3 : 577.152.311 : 577.21

Аннотация

Кожура граната содержит значительное количество активных веществ; порошок, приготовленный из высушенной корки, обладает вяжущим действием и крайне полезен при энтероколите (одновременном воспалении тонкой и толстой кишки). Порошок кожуры граната применяется для лечения различных повреждений поверхности кожи, а также при стоматологических проблемах. В кожуре граната присутствует эллаговая кислота в форме, связанной с гидролизуемыми таннинами, а также в виде соединения эллагитаннина. Эллаговая кислота обладает антиоксидантным действием и является потенциальным токсином, препятствующим росту патогенных грибов и вирусов.

Принимая во внимание возможность широкого применения в пищевой промышленности кожуры плодов граната, выращиваемого на территории Узбекистана, важное значение имеет определение химического и количественного состава основных биологически активных веществ в данном вторичном продукте, а также экстракция (выделение) из отходов кожуры плодов граната основных действующих веществ: полифенолов, флавоноидов, каротиноидов, антоцианов, катехинов, таннинов и других соединений. Кожура граната, как побочный продукт переработки, представляет интерес для микробиологических исследований. Целью данной работы является выделение микроорганизмов из кожуры граната, изучение их ферментативной активности и биологического потенциала.

Abstract

Pomegranate peel contains a significant amount of active substances; the powder prepared from the dried rind has an astringent effect and is highly beneficial for enterocolitis (simultaneous inflammation of the small and large intestines). Pomegranate peel powder is used to treat various types of skin surface damage and dental problems. Ellagic acid is present in pomegranate peel in a form bound to hydrolyzable tannins, as well as in the form of an ellagitannin compound. Ellagic acid exhibits antioxidant activity and acts as a potential toxin that inhibits the growth of pathogenic fungi and viruses.

Considering the potential for widespread application of the peel of pomegranate fruits grown in Uzbekistan within the food industry, it is of great importance to determine the chemical and quantitative composition of the main bioactive substances in this secondary product, and to extract the primary active compounds from the pomegranate fruit waste peel, including polyphenols, flavonoids, carotenoids, anthocyanins, catechins, tannins, and other compounds. Pomegranate (Punica granatum L.) is a rich source of biologically active compounds, including polyphenols, organic acids, and tannins. Pomegranate peel, as a processing byproduct, is of great interest for microbiological research. The aim of this work is to isolate microorganisms from pomegranate peel and to study their enzymatic activity and biological potential.

Ключевые слова: Кажура граната, танин, танназа, фермент, гидролиз, грибы, ферментация, микробиологический продуцент, идентификация, биотехнология, молекулярный анализ, Aspericullus oryzae Taloromyces albabiverticullus.

Keywords: Pomegranate peel, tannin, tannase, enzyme, hydrolysis, fungi, fermentation, microbiological producer, identification, biotechnology, molecular analysis, Aspergillus oryzae, Talaromyces albobiverticillius.

Введение

Актуальность. Ценность граната объясняется тем, что присутствие вышеуказанных биологически ценных веществ связано с лечебными и профилактическим свойствами, при лечении ряда инфекционных, хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, диабет и ожирение, авитаминоз, минеральные недостатки. Также, следует отметить, что почти все биоактивные компоненты, содержащиеся в кожуре граната, могут использоваться в качестве функциональных ингредиентов для лучшего усвоения, использования указанных продуктов, обеспечивая дополнительную ценность для пищевой промышленности. [1,2].

Цель исследования. Для культивирования микроорганизмов использовали среды Чапека, агар-агар, пептонный агар и крахмало-аммиачную среду. Среды стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут. Микроорганизмы выделяли из заражённой и незаражённой кожуры граната. Выращивание проводили в термостате при 30–35°C в течение 48 72 часов. Активность фермента танназы определяли с помощью 1%-го раствора хлорида железа (III) (FeCl₃).

Объекты и методы исследования. 1. На зараженную кожуру граната измельчают с помощью миксера до размера 0,5-2 см. Для выращивания микроорганизма использовали среду Чапека. Среду Чапека стерилизуют при давлении 0,5–1,0 атм в течение 30–60 минут. В среде Чапека, налитой в чашку Петри, он был получен из измельченной кожуры граната и выращен в нескольких степенях разбавления методом промывания. В жидкую среду Чапека в колбах Эрленмеера добавляли 10, 20, 40 г измельченной коры и выращивали в термостате-шейкере в течение 72 часов при температуре 35 °С и скорости 100 об/мин. Затем на поверхность плотной агаризованной среды Чапека отбирали 0,1 мл 3-суточной культуральной жидкости, высевали шпателем газонным методом и бактериологической петлей методом зигзаг и выращивали в термостате при температуре 30оС в течение 3-5 суток. Цель культивирования, выделить ассоциацию микроорганизмов, растущих на поверхности чашек, очистить и изучить некоторые биохимические свойства чистых культур

Таблица 1. Состав среды Чапека

Образцы зараженных частей граната высевали в чашки Петри на жидкую агар-агаровую среду. Этот засеянный образец инкубировали в термостатической камере при 30°С в течение 72 часов.

Таблица 2. Состав среды агар-агар

Культивирование микроорганизмов, присутствующих в кожуре граната. Выделение чистых культур из ассоциации микроорганизмов, выращенных на средах Чапека и агаризованных средах. Для этого культуры, выращенные на поверхности чашки Петри, сначала суспендируют методом промывания. Степень разбавления — 1/5. Подготавливали стерилизованную воду и чашки Петри, а пробу выращенных микроорганизмов разводили в стерильной воде в соотношении 5:1. Из 4-го и 5-го разведений по 0,1 мл добавляли в питательную среду с агаром Чапека и крахмальным аммиаком и выращивали в термостатируемой камере при температуре 30°С в течение 48 часов. Учитывая наличие в исследуемом образце бактерий, грибов и актиномицетов, для выделения чистых культур готовят питательные среды Чапека, пептонный агар и крахмально аммиачную среду. Все фильтруется. Фильтрат и чашки Петри с посевом стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 минут. Петри и пробирки разливают по 3 мл питательной среды. Штаммы были взяты из культур, выращенных на предыдущей питательной среде, и инокулированы. Его выращивали в термостате при температуре 30°С в течение 24–48 часов. Из кожуры граната были выделены микроорганизмы Aspergillus oryzae и Talaromyces albobiverticillius.

Результаты и их обсуждение

Метод MALDI-TOF MS подтвердил принадлежность штаммов к соответствующим видам. Aspergillus oryzae (штамм DFCS R24) показал высокий балльный показатель (1.77), что свидетельствует о значительной ферментативной активности. Talaromyces albobiverticillius (штамм 7F HSCS 26) также продемонстрировал высокий уровень активности (1.85). 2. При тестировании танназной активности с использованием 1%-го раствора FeCl₃ наблюдалось образование зон просветления вокруг колоний, что указывает на способность микроорганизмов расщеплять танины. Когда кольцо находится в форме красителя или пигмента (т. е. цветного кольца), это указывает на производство пигмента грибком и его неизбежное распространение (диффузию) в питательную среду. То есть кольцо представляет собой место активности фермента. FeCl₃ дает синий/черный/зеленовато-черный цвет, образуя комплекс с фенольными соединениями (дубильные вещества, другие фенолы. Было замечено, что Asperigilius oryzae и talorymcus albebverticillus, выделенные из кожуры граната, образуют кольцо при капании 1% раствора FeCl₃. Измеряется длина окрашивания. Каждый измерялся 2 раза.

1.A.oryzae (1.72) UC 3-на Чашка Петри длина 0.5мм;

2. A.oryzae (1.72) UC 3- на Чашка Петри длина 0.6мм;

3. A.oryzae DFCSR24 (1.77) UC 1 на Чашка Петри длина 20мм;

4. A.oryzae DFCSR24 (1.77) UC 1 на Чашка Петри длина 10мм;

Рисунок 1. Производство фермента танназы в Aspergillus oryzae 1% FeCl₃ формирование кольца

Talorymcus albebvertiсillus

1. T. albebvertiсillus (2.33) UC 5 на Чашка Петри длина 0.7мм;

2. T. albebvertiсillus (2.33) UC 5 на Чашка Петри длина 0.6мм;

3. T. albebvertiсillus (1.85) UC 2 на Чашка Петри длина 0.3мм;

4. T. albebvertiсillus (1.85) UC 2 на Чашка Петри длина 0.5мм;

Рисунок 2. Производство фермента танназы в Talaromyces albobiverticillius 1% FeCl₃ образование кольца

Таблица 3. Ферментативная активность штаммов

В качестве источника грибов использовались гнилые, то есть повреждённые, кожуры граната, служившие субстратом и средой обитания микрофлоры. Из них были выделены изоляты эпифитной микрофлоры. Моноколонии грибов инокулировали поверхностным методом на агаризованные селективные питательные среды. По росту, развитию и гидролизу танинов определяли танназоактивность грибных колоний.

2. Молекулярно-генетическая идентификация и филогенетический анализ. Для идентификации выделенных микроорганизмов на современном молекулярно-генетическом уровне использовали анализ последовательностей 16S rRNA (для бактерий) и 18S rRNA (для грибов). Очищенная нуклеотидная последовательность 18S рибосомальной РНК грибных изолятов была определена и сопоставлена с базой данных NCBI с помощью алгоритма BLAST. Результаты данного анализа показали, что исследуемый изолят принадлежит к роду Aspergillus, а именно к виду Aspergillus flavus.

В ходе исследования был проанализирован состав микробиоты кожуры граната. Морфологический и микроскопический анализы выявили присутствие таких бактерий, как Erwinia herbicola, Pseudomonas sp. и Micrococcus sp., а также доминирующих родов микроскопических грибов, включая Penicillium, Aspergillus, Cladosporium и Fusarium.

Таблица 3. Филогенетический анализ доминирующего штамма гриба Aspergillus flavus UC3, выделенного из кожуры граната, на основе нуклеотидных последовательностей 18S rRNA

Результаты филогенетического анализа свидетельствуют о том, что штамм Aspergillus flavus UC3 (PQ764948.1), выделенный из кожуры граната, кластеризуется со штаммом Aspergillus flavus UC1 и гибридным штаммом Aspergillus parasiticus x Aspergillus flavus, выделенным в Камеруне, демонстрируя уровень бутстрэп-поддержки 84% на основе их нуклеотидных последовательностей. Кроме того, как показано в таблице, данный штамм обнаруживает высокую степень филогенетического родства с видами Aspergillus oryzae (93%) и Aspergillus minisclerotigenes (93%).

Таблица 4. Филогенетическое положение и анализ доминирующего штамма гриба Penicillium oxalicum UC5, выделенного из кожуры граната, на основе нуклеотидной последовательности 18S рибосомальной РНК       

Результаты генетического анализа полностью подтверждают, что вторым доминирующим штаммом, выделенным из кожуры граната, является Penicillium oxalicum UC5 (PQ764863.1). Ввиду высокой консервативности гена 18S rRNA дифференциация между P. oxalicum и T. albobiverticillius может быть затруднена, так как они обладают значительным морфологическим и функциональным сходством. На филогенетическом дереве данный штамм образовал монофилетический кластер с изолятами P. oxalicum DS-2 и P. oxalicum 68. Значения бутстрэпа 91% и 100% указывают на высокую статистическую достоверность идентификации. Кроме того, анализ выявил близкое филогенетическое родство штамма P. oxalicum UC5 с видами P. daleae и P. thomi (бутстрэп-поддержка 96-100%).

Биотехнологический потенциал и оптимизация биосинтеза Полученные результаты продемонстрировали, что различные микроорганизмы способны синтезировать фермент танназу в разной степени. Aspergillus oryzae является наиболее широко используемым видом в промышленной биотехнологии благодаря высокой и стабильной ферментативной активности. Большой потенциал в качестве продуцента танназы также проявляет Talaromyces albobiverticillius. Его преимущество заключается в выраженной способности к секреции внеклеточных ферментов, что существенно облегчает процессы экстракции и очистки целевого продукта в промышленных масштабах. [3-6].

Существует перспектива создания высокоактивных штаммов-продуцентов методами селекции и генетической модификации. Оптимальными условиями для биосинтеза фермента являются: pH 5.0–6.0, температура 25–30 °C и обеспечение аэрации среды. Для точной идентификации наиболее эффективным подходом признано сочетанное применение морфологических, биохимических и молекулярно-генетических методов. Если морфологические и биохимические тесты целесообразны для предварительной оценки, то молекулярные методы остаются основным инструментом для точной идентификации на уровне вида.

Выводы

Из кожуры граната были выделены микроорганизмы Aspergillus oryzae и Talaromyces albobiverticillius. Данные штаммы продемонстрировали высокую ферментативную активность, включая способность к деградации танинов. Полученные результаты подтверждают перспективность использования изолированных штаммов в биотехнологии и пищевой промышленности.

Aspergillus oryzae признан одним из наиболее эффективных мировых продуцентов танназы. Высокая ферментативная активность, способность расти на недорогих субстратах и широкий спектр промышленного применения повышают его биотехнологическую ценность. В перспективе эффективность продукции танназы штаммами Aspergillus oryzae может быть повышена за счет методов генетической инженерии и оптимизации технологий ферментации.

Talaromyces albobiverticillius рассматривается как перспективный вид микроскопических грибов, способный выступать эффективным продуцентом танназы. Биотехнологическая значимость данного фермента обусловлена его широким применением в пищевом, фармацевтическом, кожевенном секторах и в сфере охраны окружающей среды. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на углубленном изучении генетических и биохимических свойств этого вида, разработке высокоактивных танназопродуцирующих штаммов и их внедрении в промышленное производство [7-10].

Список литературы:

1. M.A. Rabie, H. Mohamed. Oxidative stability of edible oils via addition of pomegranate and orange peel extracts.  Foods and raw materials. Том 6, №2, 2018. DOI 10.21603//2308-4057-2018-2-413-420.
2. Gamal El-Sharnouby, Hany Mohamed Fahmy. Quality Characteristics of Fortified Cupcake by Pomegranate Peels Powder as Natural Source of Antioxidants and some Bioactive Components. International journal of food science  (2017) 22:1606. doi: 10.3390//molecules 22101606.
3. Aguilar C.N., et al. Microbial tannase: Advances and applications. Applied icrobiology and Biotechnology, 2019. 103 (7), P. 2561–2575.
4. Belur P.D., & Mugeraya G.. Microbial production of tannase: State of the art.Research Journal of Biotechnology, 2020/ 15 (4), P. 167–176.
5. Natarajan K. & Kumar A. (2022). Identification of tannaseproducing microorganisms using molecular tools. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 32 (2), P. 145-156.
6. Banerjee D., Mondal K.C., Pati B.R. Production and characterization of extracellular tannase from Aspergillus oryzea. Food Microbiology, 2001. 18 (5), -P.511–516.
7. Belur P.D., Mugeraya G. Microbial production of tannase: State of the art. Research Journal of Microbiology, 2011. 6 (1), -P.25–40.
8. F.KH. Eshmatov, K.O. Dodayev, S.SH. Kasymova, S.K. Atkhamova. Aminokislotnyy sostav kozhury granatov // Khraneniye i pererabotka sel'khozsyr'ya. -2014. -№ 8. -С. 19-20.
9. Eshmatov F.KH., Dodayev K.O., Khasanov KH.T. Pererabotka plodov granata na soki i kontsentraty // Pivo i napitki. –2005. – № 2. – С. 46-47.
10. F.KH. Eshmatov, D.K. Maksumova, L.K. Dodayeva i dr. Sredstva vozdeystviya na tanin v granatovom soke i kozhure // Pishchevaya promyshlennost. -2016. -№ 2. -С. 36-38.
11. Suyundikov U.A.,Dodayev Kˌ.O.,Botirova F.D. Izvlecheniyei issledovaniye natural'nykh krasiteley i dubil'nykh veshchestv kozhury granata // Universum: tekhnicheskiye nauki vypusk 3 (96)  2022. –C. 39-42.
12. Eshmatov F.KH., Dodayev K.O., Maksumova D.K. Udaleniye limonnoy kisloty i tanina iz granatovogo soka // Khraneniye i pererabotka sel'khozsyr'ya. - Moskva, 2012. - № 11. - С. 16-19. 
13. Eshmatov F.KH., Dodayev K.O., Maksumova D.K. Khimicheskiy sostav komponentov mutnosti i osadka granatovogo soka // Khraneniye i pererabotka sel'khozsyr'ya. –М.: 2013. - № 4.  - С. 36-37.