Screening of promising bioagents against virulent phytopathogens of cotton and statistical evaluation of their effectiveness
УДК 632.937
Аннотация
Целью исследования явилась сравнительная оценка антифунгальной активности перспективных бактериальных штаммов в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium и Alternaria. Установлено, что наиболее высокой антагонистической активностью характеризовался штамм Azospirillum brasilense 1–7, обеспечивший ингибирование радиального роста всех исследованных фитопатогенов с показателями RI 54,16–61,9 %, при максимальном значении 61,9 % для Fusarium sp.1. Высокую эффективность также продемонстрировали Bacillus subtilis 1 и Bacillus thuringiensis 1fo, при этом максимальный показатель RI у B. subtilis 1 достигал 64,1 % в отношении Fusarium sp.28. Штаммы Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida проявили умеренную антифунгальную активность, тогда как Bacillus safensis MB26, B. subtilis 2 и B. thuringiensis 26 ингибировали рост лишь отдельных фитопатогенов. Штамм Azotobacter chroococcum sp. антагонистической активности не проявил. Антагонистическую активность определяли методом двойных культур на агаризованной питательной среде, а статистическую обработку результатов проводили с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) при уровне значимости p < 0,05.
Abstract
The aim of this study was to comparatively evaluate the antifungal activity of promising bacterial strains against phytopathogenic fungi of the genera Fusarium and Alternaria. The strain Azospirillum brasilense 1–7 exhibited the highest antagonistic activity, inhibiting the radial growth of all tested phytopathogens with RI values ranging from 54.16 to 61.9 %, with the highest value (61.9 %) recorded against Fusarium sp.1. High antifungal activity was also demonstrated by Bacillus subtilis 1 and Bacillus thuringiensis 1fo, with the maximum RI value of 64.1 % observed for B. subtilis 1 against Fusarium sp.28. Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida exhibited moderate antifungal activity, whereas Bacillus safensis MB26, B. subtilis 2, and B. thuringiensis 26 inhibited the growth of only selected phytopathogens. No antagonistic activity was detected for Azotobacter chroococcum. Antagonistic activity was assessed using the dual culture assay on solid agar medium, and the experimental data were statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA) at a significance level of p < 0.05.
Ключевые слова: хлопчатник; агенты биологического контроля; фитопатогенные грибы; Fusarium spp; Alternaria sp; бактерии-антагонисты; антифунгальная активность.
Keywords: cotton; biological control agents; phytopathogenic fungi; Fusarium spp; Alternaria sp; antagonistic bacteria; antifungal activity.
Введение
Фитопатогенные грибы остаются одним из основных факторов, ограничивающих урожайность и фитосанитарную устойчивость сельскохозяйственных культур. По данным исследований, потери урожая вследствие болезней растений достигают 20–30 %, при этом значительная часть ущерба обусловлена развитием грибов родов Fusarium, Alternaria, Verticillium, Rhizoctonia и других [30]. Хлопчатник (Gossypium hirsutum L.) особенно подвержен грибным заболеваниям, распространяющимся через почву и семена, что существенно снижает его продуктивность [10].
Грибы родов Fusarium и Alternaria вызывают корневые гнили, трахеомикозное увядание, некрозы стеблей и листьев, нанося значительный экономический ущерб сельскому хозяйству [4, 19]. При фузариозном увядании хлопчатника поражаются корневая система и проводящие ткани, нарушается транспорт воды и питательных веществ, что приводит к увяданию и гибели растений [29]. Представители рода Alternaria вызывают некрозы листьев и стеблей, ухудшение качества семян и снижение урожайности [27]. Распространению заболеваний способствуют климатические изменения, длительное возделывание культур в условиях монокультуры и деградация почвенной микробиоты [31].
Продолжительное применение химических фунгицидов способствует формированию устойчивости патогенов, сокращению численности полезных микроорганизмов, нарушению экологического равновесия почвы и накоплению токсичных остатков в окружающей среде [17, 7, 33]. В связи с этим разработка экологически безопасных методов защиты растений на основе агентов биологического контроля (Biological Control AgentsBCA), в частности ризобактерий, стимулирующих рост растений (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR), является актуальным направлением современной фитопатологии [11, 25, 5].
Бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum и Azotobacter рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля и стимуляции роста растений [1]. Представители рода Bacillus отличаются спорообразованием, устойчивостью к неблагоприятным условиям и высокой метаболической пластичностью [6]. Они синтезируют антифунгальные липопептиды — итурин, фенгицин, сурфактин и бацилломицин, эффективно ингибирующие развитие возбудителей фузариоза и альтернариоза [4, 15, 26, 14]. Биопрепараты на основе Bacillus subtilis успешно применяются для повышения устойчивости агроэкосистем и стабильности сельскохозяйственного производства [8, 23].
Представители рода Pseudomonas также обладают выраженной антагонистической активностью, обусловленной синтезом сидерофоров, феназинов, пиолютеорина, цианистого водорода и других вторичных метаболитов, подавляющих развитие фитопатогенов [7, 15, 9].
Эффективность штаммов Pseudomonas putida и Pseudomonas aeruginosa в качестве агентов биологического контроля против Fusarium oxysporum, Alternaria alternata и других фитопатогенных грибов подтверждена рядом исследований [3, 32].
Штаммы рода Azospirillum, традиционно рассматриваемые как продуценты фитогормонов и азотфиксирующие микроорганизмы, в последние годы привлекают внимание как перспективные агенты биоконтроля. Установлено, что Azospirillum brasilense синтезирует литические ферменты (хитиназу и β-1,3-глюканазу), антифунгальные метаболиты и индуцирует системную резистентность растений (ISR), обеспечивая выраженный фунгистатический эффект [20, 2, 12]. Наряду с этим Azotobacter chroococcum рассматривается как многофункциональный микроорганизм, повышающий плодородие почвы, стимулирующий рост растений и обладающий биоконтрольным потенциалом [21]. Вместе с тем эффективность бактериальных антагонистов определяется их генетическими особенностями, штаммовой специфичностью и вирулентностью фитопатогенных изолятов, что может обусловливать вариабельность результатов in vitro [21].
Одним из наиболее информативных методов скрининга микроорганизмов-антагонистов является метод двойной культуры (dual culture assay) in vitro [24, 13, 28]. Он позволяет оценить ингибирование роста грибного мицелия, конкурентные взаимодействия за субстрат и влияние диффундирующих внеклеточных биоактивных метаболитов [15, 13, 28]. Для количественной оценки антагонистической активности широко применяют показатели ингибирования радиального роста (RI, %) и индекс зоны ингибирования (IZI) [28]. Высокую эффективность демонстрирует модификация метода «газон–лунка», обеспечивающая стабильное взаимодействие между антагонистом и патогеном и точную оценку действия диффундирующих метаболитов [4].
Достоверность результатов экспериментов методом двойной культуры оценивают с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), критерия Тьюки (Tukey HSD) и критерия Краскела–Уоллиса (Kruskal–Wallis), что соответствует современным требованиям микробиологических исследований [36, 19]. Изучение способности новых бактериальных изолятов, выделенных из агробиоценозов хлопчатника Сырдарьинской области, подавлять рост фитопатогенных грибов и статистическая оценка их штамм-специфических особенностей являются важным этапом разработки экологически безопасных биофунгицидов нового поколения.
Целью настоящего исследования являлась сравнительная оценка антифунгальной активности штаммов бактерий-антагонистов различных таксономических групп в отношении Fusarium spp. и Alternaria sp. с использованием модифицированного метода двойной культуры «газон–лунка», выявление перспективных агентов биологического контроля и статистическая оценка полученных результатов методом дисперсионного анализа в программной среде R.
Материалы и методы исследования
Антифунгальную активность бактериальных штаммов оценивали методом двойной культуры (dual culture assay), позволяющим исследовать прямые антагонистические взаимодействия между бактериями и фитопатогенными грибами, а также оценить способность бактерий к колонизации субстрата и синтезу диффундирующих биоактивных метаболитов in vitro [26, 13].
Фитопатогенные грибы культивировали на картофельно-декстрозном агаре (PDA), бактериальные штаммы — на питательном агаре (PA) методом газонного посева. После формирования бактериального газона стерильным пробойником вырезали агаровые блоки, переносили их в чашки Петри с PDA, дополненным пептоном (5 г/л), и размещали напротив грибного инокулюма. Инкубацию проводили при 27 °C в течение 10 суток [11, 26].
Антифунгальную активность оценивали по показателю ингибирования радиального роста (RI, %), который рассчитывали по формуле:
RI (%) = ((r₁ − r₂) / r₁) × 100,
где R1 — радиус грибной колонии в контроле; R2 — радиус грибной колонии со стороны бактериального антагониста [11, 34, 16].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы RStudio (версия 4.3.2). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения (Mean ± SD) по трём независимым повторностям. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования
В ходе исследования антифунгальная активность штаммов бактерий-антагонистов в отношении различных фитопатогенных грибов была оценена по показателю радиального ингибирования роста (RI, %). Полученные результаты показали существенные различия в уровне антагонистического потенциала между исследованными бактериями. Реакция каждого бактериального штамма по отношению к фитопатогенам была проанализирована отдельно.
Результаты оценки антагонистической активности бактериальных штаммов в отношении фитопатогенных грибов показали наличие существенных различий между исследуемыми штаммами (табл. 1).
Наиболее высокие показатели ингибирования радиального роста были отмечены у штамма A. brasilense 1–7. Данный штамм проявил стабильную антагонистическую активность в отношении всех исследованных фитопатогенов, при этом значения RI варьировали в пределах 54,16–61,90 %. Наиболее выраженный уровень ингибирования был зарегистрирован в отношении изолята Fusarium sp.1 (61,9 %), тогда как для остальных изолятов Fusarium значения RI также превышали 55 % (рис. 1).
Штамм B. thuringiensis 1fo также продемонстрировал широкий спектр антагонистической активности. В отношении Alternaria sp. и Fusarium sp. значения RI составили соответственно 57,5 и 56,25 %, тогда как для остальных изолятов Fusarium уровень ингибирования находился в диапазоне 47,76–53,84 % (рис. 2).
B. subtilis 1 проявил антагонистическую активность в отношении всех исследованных фитопатогенов. Наиболее высокая эффективность данного штамма была отмечена в отношении изолята Fusarium sp.28, где значение RI составило 64,1 %. В отношении остальных фитопатогенов значения RI варьировали от 45,83 до 58,33 %, что свидетельствует о наличии у данного штамма стабильного антагонистического потенциала в отношении различных фитопатогенов (рис. 3).
Штаммы P. aeruginosa и P. putida проявили антагонистическую активность средней степени в отношении всех фитопатогенов, использованных в эксперименте. Значения RI в отношении Alternaria sp. и Fusarium sp. составили соответственно 39,58 и 43,5 %. Для отдельных изолятов Fusarium уровень ингибирования превышал 50 %. В частности, штамм P. putida продемонстрировал одинаковые значения RI (59,52 %) в отношении изолятов Fusarium sp.34 – 1 и Fusarium sp.34 – 2 (рис. 4 и 5).
B. safiensis MB26 проявил антагонистическую активность только в отношении Alternaria sp. и общего изолята Fusarium sp., при этом значения RI составили соответственно 43,75 и 43,5 %. Однако в отношении отдельных изолятов Fusarium антагонистическая активность не наблюдалась (рис. 6).
Аналогичная картина была отмечена у штаммов B. subtilis sp.2 и B. thuringiensis 26. Данные штаммы проявили антагонистическую активность в отношении Alternaria sp. и общего изолята Fusarium sp., где значения RI составили соответственно 41,58 и 50 %, а также 27,5 и 45,75 %, однако ингибирования роста отдельных изолятов Fusarium не наблюдалось (рис. 7 А и Б). Штамм A. chroococcum sp. не проявил антагонистической активности в отношении всех исследованных фитопатогенов.
Таблица 1.
Антифунгальная активность штаммов бактерий-антагонистов (RI, %, среднее значение ± SD, n = 3)
| Бактериальный штамм | Alternaria sp. | Fusarium sp. | Fusarium sp.1 | Fusarium sp.28 | Fusarium sp.34-1 | Fusarium sp.34-2 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Среднее значение RI (%) | ||||||
| A. brasilense 1–7 | 56,25 ± 2,2 | 54,16 ± 1,4 | 61,9 ± 4,1 | 60,68 ± 0,9 | 56,55 ± 4,3 | 55,86±3,6 |
| B. safiensis MB26 | 43,75 ± 2,8 | 43,5 ± 3,2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B. subtilis 1 | 58,33 ± 2,3 | 45,83 ± 1,5 | 50,0 ± 0,0 | 64,1 ± 2,2 | 51,28 ± 4,4 | 51,28±4,4 |
| B. subtilis 2 | 50 ± 0,8 | 45,75 ± 1,5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B. thuringiensis 26 | 41,58 ± 0,4 | 27,5 ± 1,7 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| P. aeruginosa sp. | 39,58 ± 1,6 | 41,66 ± 1,2 | 50,0 ± 7,1 | 54,76± 4,1 | 56,19 ± 1,6 | 52,38±5,6 |
| P. putida sp. | 41,67 ± 0,9 | 43,5 ± 0,9 | 50,0 ± 7,1 | 54,38 ± 2,3 | 59,52 ± 4,1 | 59.52±8,2 |
| B. thuringiensis 1fo | 57.5 ± 1,5 | 56,25± 1,8 | 50,0 ± 0,0 | 53,84 ± 3,1 | 47,76 ± 2,0 | 51,28±4,4 |
| A. chroococcum sp. | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
В целом среди исследованных штаммов наиболее высокая и стабильная антагонистическая активность была зарегистрирована у A. brasilense 1–7, B. subtilis sp.1 и B. thuringiensis 1fo. Штаммы рода Pseudomonas проявили антагонистическое действие средней степени, сохранявшееся в отношении всех исследованных фитопатогенов. В отличие от них, антагонистическая активность B. safiensis MB26, B. subtilis sp.2 и B. thuringiensis 26 была ограничена в отношении отдельных фитопатогенов, тогда как штамм A. chroococcum sp. в исследуемых условиях не проявил антагонистических свойств.
Обсуждение
Результаты исследования показали существенные различия в уровне антифунгальной активности между бактериями-антагонистами. Наиболее высокая активность была отмечена у штаммов Azospirillum brasilense, Pseudomonas putida и Bacillus thuringiensis, что свидетельствует о том, что антагонистические свойства зависят не столько от видовой принадлежности микроорганизма, сколько от генетических и метаболических особенностей конкретного штамма.
Высокая антифунгальная активность Azospirillum brasilense согласуется с данными Mehanni и El-Katatny [18]. Авторы установили, что штаммы Azospirillum обеспечивали ингибирование роста Fusarium oxysporum на уровне 95–100 %. Хотя полученные нами результаты были несколько ниже, различия могут быть обусловлены особенностями используемых штаммов бактерий и изолятов фитопатогенов. Тем не менее, полученные данные подтверждают высокий биоконтрольный потенциал представителей рода Azospirillum [18].
Согласно данным Yasmin и соавт. [34], штамм Pseudomonas aeruginosa Z5 ингибировал рост Fusarium oxysporum на 82,5 %, а в отношении некоторых других фитопатогенов уровень ингибирования достигал 86,5–91,5 %. В нашем исследовании антифунгальная активность P. aeruginosa была ниже указанных значений, однако Pseudomonas putida продемонстрировал более высокую активность в отношении отдельных изолятов. Это подтверждает штаммоспецифический характер антагонистических свойств бактерий [34].
Liang и соавт. [16] показали, что штамм Bacillus thuringiensis GBAC46 эффективно подавляет развитие грибов рода Fusarium. Аналогично, в нашем исследовании штамм B. thuringiensis 1fo проявил высокую антифунгальную активность, тогда как другой штамм того же вида — B. thuringiensis 26 — характеризовался значительно более низкой активностью. Данный факт указывает на существенные различия биоконтрольного потенциала между штаммами одного вида [16].
По данным Zhang и соавт. [35], фэнгицины, продуцируемые Bacillus subtilis, практически полностью подавляют рост Alternaria solani. В нашем исследовании штамм B. subtilis 1 также проявил выраженную антифунгальную активность, тогда как B. subtilis 2 оказывал значительно более слабое воздействие на некоторые фитопатогенные грибы. Вероятно, это связано с различиями в экспрессии генов, отвечающих за синтез липопептидов [35].
Prakash и Arora [22] установили, что штамм Bacillus safensis STJP практически полностью подавляет мицелиальный рост и образование конидий Alternaria alternata. В отличие от этого, штамм B. safiensis MB26, исследованный в нашей работе, проявил сравнительно более низкую антифунгальную активность, что, вероятно, обусловлено различиями в метаболической активности исследуемых штаммов [22].
У Azotobacter chroococcum антифунгальная активность не была выявлена. Полученные результаты согласуются с литературными данными, согласно которым основное значение представителей данного рода связано не с биоконтролем фитопатогенов, а с фиксацией атмосферного азота и стимуляцией роста растений.
Заключение
Результаты проведённого исследования показали, что антифунгальная активность бактериальных штаммов-антагонистов существенно варьирует в зависимости от вида фитопатогенного гриба. Наиболее высокую антагонистическую активность в отношении изолятов Fusarium sp.34 – 1 и Fusarium sp.34 – 2 продемонстрировали штаммы Pseudomonas putida sp. и Azospirillum brasilense 1–7. В отношении Alternaria sp. и Fusarium sp., выделенных из корневой системы и стеблей хлопчатника, наибольшая эффективность была зарегистрирована у штамма B. thuringiensis 1fo.
Статистический анализ подтвердил наличие достоверных различий между исследованными бактериальными штаммами по уровню антифунгальной активности в отношении отдельных фитопатогенов. В то же время штамм Azotobacter chroococcum sp. не проявил антифунгальной активности ни в одном из исследованных вариантов.
Полученные результаты позволяют рассматривать штаммы Bacillus thuringiensis 1fo, Pseudomonas putida и Azospirillum brasilense 1–7 в качестве перспективных агентов биологического контроля для защиты хлопчатника от фитопатогенных грибов.
Благодарность
Мы выражаем благодарность Институту микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, который выполнил основную базовую работу по данной теме, за создание достаточных условий для проведения экспериментов в лаборатории.
Список литературы
