DETERMINATION OF ACUTE TOXICITY AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF WATER-SOLUBLE METAL COMPLEXES OF POLYGALACTURONIC ACID

УДК 547.458.88:544.142.3:615.281

Аннотация

В данной научно-исследовательской работе подробно и всесторонне исследовано влияние степени комплексообразования полигалактуроновой кислоты (ПГК) с ионами различных биогенных металлов, таких как медь, цинк и кобальт, на ключевые биологические показатели их острой токсичности и выраженной антимикробной активности. Актуальность проведенного исследования обусловлена необходимостью целенаправленного поиска и создания новых безопасных биомедицинских препаратов и эффективных антисептических средств на основе экологически чистых возобновляемых растительных полимеров. В ходе выполнения комплексного экспериментального исследования было установлено, что полученные водорастворимые металлокомплексы относятся к умеренно‑ и малотоксичным соединениям, что открывает широкие практические перспективы для их дальнейшего безопасного применения в медицине и фармации. Подробно изучено специфическое ингибирующее воздействие синтезированных комплексных соединений на широкий спектр распространенных тест-штаммов патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

В результате проведенных микробиологических тестов было наглядно показано и доказано, что кобальт-, медь- и цинк-производные полигалактуроновой кислоты проявляют стабильную и выраженную антимикробную активность в оптимальном диапазоне рабочих концентраций от 2,5 до 10 мас. %.

Полученные авторами экспериментальные данные позволяют сделать важный теоретический вывод о наличии прямой зависимости антибактериальных свойств от природы координированного металла и плотности зарядов в полимерной макромолекуле. Полученные  данные обосновывают перспективность дальнейшего изучения антимикробного потенциала  металлокомплексных систем в качестве перспективных кандидатов для создания инновационных отечественных лекарственных средств широкого антимикробного спектра действия, а также биодеградируемых терапевтических материалов с пролонгированным эффектом. Данная работа вносит существенный вклад в развитие современной химии высокомолекулярных соединений, направленной на химическую модификацию природных полисахаридов с целью улучшения их функциональных характеристик и снижения общей токсической нагрузки на живые организмы.

Abstract

This research study provides a detailed and comprehensive examination of the influence of the degree of complexation of polygalacturonic acid (PGA) with ions of various biogenic metals, such as copper, zinc, and cobalt, on key biological indicators of their acute toxicity and pronounced antimicrobial activity. The relevance of this study stems from the need for a targeted search for and development of new, safe biomedical products and effective antiseptics based on environmentally friendly, renewable plant polymers. A comprehensive experimental study established that the resulting water-soluble metal complexes are moderately and low-toxic compounds, opening up broad practical prospects for their further safe use in medicine and pharmacy. The specific inhibitory effects of the synthesized complexes on a wide range of common test strains of pathogenic and opportunistic microorganisms were studied in detail.

The influence of the complexation degree of polygalacturonic acid (PGA) with copper, zinc, and cobalt ions on toxicity and antimicrobial properties was investigated. It was found that the obtained water‑soluble metal complexes belong to the moderately and slightly toxic compounds. Their effect against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms was studied. Cobalt‑, copper‑, and zinc‑PGA complexes exhibited pronounced antimicrobial activity at 2.5–10 wt%.

The obtained data substantiate the prospects for further study of the antimicrobial potential of metal complex systems as promising candidates for the creation of innovative domestic drugs with a broad antimicrobial spectrum of action, as well as biodegradable therapeutic materials with a prolonged effect. This work makes a significant contribution to the development of modern macromolecular chemistry aimed at chemical modification of natural polysaccharides in order to improve their functional characteristics and reduce the overall toxic load on living organisms.

Ключевые слова: полигалактуроновая кислота, металлокомплексы, токсичность, антимикробная активность, пектины.

Keywords: polygalacturonic acid, metal complexes, toxicity, antimicrobial activity, pectin.

Введение

Пектины и их производные, в частности полигалактуроновая кислота, способны образовывать устойчивые комплексы с ионами тяжёлых и переходных металлов [13]. Комплексообразование изменяет биологическую активность и токсикологические характеристики исходных соединений. Цель исследования — установить взаимосвязь между составом металлокомплексов ПГК и их токсичностью, а также антимикробной активностью.

На основе проведенного анализа соответствующей научной литературы показано, что пектины обладают высокой физиологической активностью, низкой токсичностью, биологической активностью. Установление взаимосвязи влияния структурной особенности ПГК при взаимодействии с ионами металлов, получение новых биологически активных комплексных соединений ПГК представляется актуальной задачей химии полимеров. Несмотря на многочисленные исследования в рассматриваемом направлении, литературных источников по изучению закономерностей образования металокомплексов ПГК представлено недостаточно.

Разработка безопасных и эффективных противомикробных средств на основе природных полимеров — одна из главных задач современной фармакологии. Включение ионов металлов в структуру полигалактуроновой кислоты (основы пектина) позволяет создавать водорастворимые комплексы с пролонгированным лечебным действием, минимизируя при этом токсичность.

Появление устойчивых штаммов микроорганизмов требует поиска новых антимикробных агентов. Использование макромолекулярных матриц повышает эффективность антибиотиков и снижает их побочные эффекты. Полигалактуроновая кислота является нетоксичным, биодеградируемым природным полисахаридом, который идеален для создания систем доставки лекарств, а также хелатных комплексов полисахаридов с биогенными металлами, которые проявляют выраженную антибактериальную и фунгицидную активность, что делает подобного рода исследования актуальными.

Оценка профиля безопасности (острая токсичность) новых металлокомплексов определяет их терапевтический индекс. Комплексный скрининг антимикробного действия на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также грибы, позволяет обосновать создание новых лекарственных форм для медицины и ветеринарии.

Цель исследования — установить характер взаимосвязи между составом (степенью комплексообразования) металлокомплексов полигалактуроновой кислоты с ионами меди, цинка и кобальта, их показателями острой токсичности и антимикробной активности.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Синтезировать водорастворимые металлокомплексы на основе полигалактуроновой кислоты с различной степенью связывания ионов меди, цинка и кобальта.
2. Провести физико-химический анализ структуры полученных соединений и определить точную степень комплексообразования.
3. Экспериментально оценить параметры острой токсичности полученных металлокомплексов in vivo и установить класс их опасности.
4. Провести скрининг антимикробного и фунгицидного действия синтезированных соединений in vitro в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
5. Выявить зависимость «структура — биологическая активность» и определить оптимальный диапазон концентраций (в мас. %), обеспечивающий выраженный терапевтический эффект.

Материалы и методы

К суспензии очищенной полигалактуроновой кислоты (ПГК) массой 1,00 г (5,68 ммоль по мономерному звену) в 40 мл деионизованной воды покапельно добавляли 1 М раствор NaOH при постоянном перемешивании до полного растворения полимера и достижения значения pH 6,5–7,0. К полученному раствору натриевой соли ПГК при интенсивном перемешивании покапельно добавляли 0,1 М водный раствор соответствующей соли металла:

Для ПГКNaCu: ацетат меди(II) Cu(CH₃COO)₂·H₂O;

Для ПГКNaCo: ацетат кобальта(II) Co(CH₃COO)_2·H₂O;

Для ПГКNaZn: ацетат цинка Zn(CH₃COO)_2·H₂O.

Примечание: количество соли рассчитывали из стехиометрического соотношения металл:мономерное звено = 1:4 (что составило 1,42 ммоль).

Реакционную смесь выдерживали при температуре 40⁰C в течение 2 ч. Перемешивание и нагрев осуществляли на магнитной мешалке IKA C-MAG HS 7 (IKA-Werke GmbH, Германия). Полученные металлокомплексы осаждали из реакционной среды добавлением двухкратного объема 96%-го этанола. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием на центрифуге Eppendorf 5810 R (Eppendorf, Германия) при 4500 об/мин в течение 12 мин.

Для удаления избытка несвязавшихся ионов металлов осадок многократно (не менее 3 раз) промывали 70%-м водным раствором этанола до отрицательной качественной реакции маточного раствора на ионы соответствующего металла. Очищенный целевой продукт промывали абсолютным этанолом, сушили в вакуумном сушильном шкафу Binder VD 23 (Binder, Германия) при температуре 40⁰C до постоянной массы и измельчали.

Физико-химическая характеристика продуктов

Количественное содержание ионов Cu²⁺, Co²⁺ и Zn²⁺ в полученных полигалактуронатах определяли методом прямого комплексонометрического (трилонометрического) титрования 0,01М раствором ЭДТА (Трилон Б) в присутствии соответствующих индикаторов (мурексида для Cu²⁺ и Co²⁺, эриохрома черного Т для Zn²⁺ после предварительного кислотного гидролиза навески полимера.

Содержание ионов натрия Na⁺ определяли методом пламенной фотометрии на фотометре BWB-XP (BWB Technologies, Великобритания). Массовая доля металлов составила: ПГКNaCu: Cu — 4,25 %, Na — 5,10 %; ПГКNaCo: Co — 3,95 %, Na — 5,32 %; ПГКNaZn: Zn — 4,31 %, Na — 5,15 %. ИК-Фурье спектроскопия: ИК-спектры исходной ПГК и синтезированных комплексов регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Bruker ALPHA (Bruker Optik GmbH, Германия) в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне волновых чисел 4000–400 см^-1 с разрешением 4 см^-1 (число сканирований — 24). Координацию ионов металлов подтверждали по смещению полос асимметричных ν_as (COO^-) и симметричных ν_as (COO^-) валентных колебаний карбоксилатных групп в области 1600–1400 см^-1.
Элементный анализ выполнен на автоматическом CHNS-анализаторе EuroVector EA3000 (EuroVector, Италия):

ПГКNaCu: найдено, %: C — 31,50; H — 3,82. Вычислено, %: C — 31,75; H — 3,78.

ПГКNaCo: найдено, %: C —31,62; H —3,88. Вычислено, %: C —31,84; H—3, 81.

ПГКNaZn: найдено, %: C — 31,41; H — 3,79. Вычислено, %: C — 31,68; H — 3,75.

Острую токсичность водорастворимых металлокомплексов определяли на беспородных белых мышах при однократном внутрибрюшинном (в/б) способе введения. Соединения вводили в диапазоне от 50 до 1500 мг/кг. Величину LD₅₀ определяли по [6] на 5 день наблюдения. Установлено, что изучаемые соединения, согласно классификации токсичных веществ, относятся к умеренно- и малотоксичным соединениям. Данные по токсичности приведены в таблице 1.

Таблица 1. Токсичность водорастворимых металлокомплексов ПГК

Параметры антимикробного тестирования

Антимикробную активность металлокомплексов ПГК оценивали методом диффузии в агар (луночным методом) в соответствии с руководствами МУК 4.2.1890-04. В работе использовали референтные штаммы микроорганизмов: грамположительные бактерии Staphylococcus aureus ATCC 29213, грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922 и дрожжеподобные грибы Candida albicans ATCC 10231.

Состав сред: для тестирования бактериальных культур использовали плотную среду — агар Мюллера — Хинтона (Mueller-Hinton Agar, HiMedia Laboratories, Индия). Для грибов C. albicans применяли агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud Dextrose Agar, HiMedia Laboratories, Индия).

Подготовка инокулята. Суточные культуры микроорганизмов суспендировали в стерильном 0,9 %-м растворе NaCl. Мутность полученной бактериальной взвеси доводили до 0,5 единиц по стандарту МакФарланда с использованием денситометра Biosan DEN-1 (Biosan, Латвия), что соответствует концентрации ≈1,5 10⁸ КОЕ/мл. Инокулят равномерно наносили на поверхность застывшего агара в чашках Петри стерильным марлевым тампоном в трех направлениях для получения сплошного газона роста.

Условия инкубации. В застывшем агаровом слое с помощью стерильного металлического пробойника вырезали лунки диаметром 6,0 мм. В каждую лунку вносили по 50 мкл растворов исследуемых полигалактуронатов в стерильной деионизованной воде в концентрации 2,0 мг/мл. Чашки Петри с бактериальными культурами инкубировали в термостате Binder BD 56 (Binder, Германия) при температуре 37⁰ C в течение 24 ч, чашки с C. albicans — при температуре 30 ⁰C в течение 48 ч.

Критерии оценки активности. Антимикробную активность оценивали по диаметру зон задержки роста микроорганизмов вокруг лунок. Измерения проводили с точностью до 0,1 мм с помощью цифрового штангенциркуля Mitutoyo ABSOLUTE (Япония), включая диаметр самой лунки.

Отрицательный контроль: стерильная деионизованная вода и исходный раствор ПГКNa.

Положительный контроль (эталон): Цефтазидим (для бактерий) и Нистатин (для грибов).

В таблице 5 представлена длительность жизнеспособности микроорганизмов в растворе ПГК на физиологическом растворе. При его концентрации ПГК в среде 5% в течении 1 — 4 часов полностью теряли жизнеспособность P. vulgaris, P. aeruginosa, S. viridans, B. subtilis. При концентрациях 2,5 % и 1 % теряли жизнеспособность стрептококки и B. subtilis.

Таблица 2. Длительность (в часах) жизнеспособности микроорганизмов в растворах полигалактуроновой кислоты различной концентрации

Результаты и обсуждение

Устойчивыми к пектиновым растворам при всех исследуемых концентрациях оказались микроорганизмы C. albicans. В 1%-ном растворе ПГК все микроорганизмы были более устойчивы, чем в 2,5%-ной и 5%-ной концентрациях. В результате проведенных исследований выявлено, что полученная ПГК оказывают антибактериальное действие на представителей наиболее распространенных штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. На жизнеспособность дрожжей C. albicans пектин не влияет.

В данном исследовании также проведено испытание антимикробной активности лигандов (табл. 3).

Таблица 3. Антимикробная активность металлокомплексов

Антимикробное действие натрий‑, кобальт‑ полигалукторонат — ПГКNaCo, натрий‑, медь‑полигалукторонат ПГКNaCu и натрий‑, цинк-полигалукторонаты (ПГКNaCo) было изучено в концентрации 0,25–10 мас.% в общей сложности на пяти штаммах грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов стандартными методами [8].

Если на средах с препаратом наблюдается заметное уменьшение количества колоний на чашках (более 70 %) по сравнению с контролем или отсутствие ростатест‑микроорганизмов, это свидетельствует о наличии антимикробного действия (табл. 3).

Заключение

Из представленных данных видно, что антимикробным действием в отношении всех тест‑микроорганизмов обладают натрий‑, кобальт‑ и цинк-полигалукторонаты в концентрации (2,5–10) мас.%. Натрий‑, медь‑ полигалукторонаты (ПГКNaCu) не угнетают рост бактерии Pseudomonas aeruginosa 9027, в отношении остальных тест‑микроорганизмов обладают антимикробным действием в концентрации 10 и 5 %.

Таким образом, экспериментально на штаммах грамположительных (Staphylococcus aureus АТСС 209p, Bacilluscereus АТСС 8035), грамотрицательных (Escherichiacoli CDC F-50, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027) бактерий и грибов (Candida albicans) установлена антимикробная активность ПГКNaCo, ПГКNaCu и ПГКNaZn.

Список литературы:

1. Рашидова С.Ш., Семенова Л.Н., Мирсагатова Д.А. Технологические особенности комплексной переработки лимоннов сорта «Ялонгоч» // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. —Барнаул, 2002. — С. 281–285.
2. Хайдаров С.Х., Мухиддинов З.К. Исследование особенности периодатного окисления карбоксиметилцеллюлозы и полигалактуроновой кислоты // Известия Академии наук Республики Таджикистан. — 2023. — № 2 (181). — С. 45–53
3. Халиков Д.Х., Мирзоева Р.С., Бободжонова Г.Н.О сорбционной активности пектиновых полисахаридов по отношению к ионам металлов // Доклады АН Республики Таджикистан. — 2017. — Т.60. — № 7–8. — С. 333–341.
4. Юсупова Ю.А., Ходжаева С.А., Мухиддинов З.К. Anti-tumor activity of cobalt-containing complexes of potassium and sodium polygalacturonates and pharmacological compositions based on them // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2024. — Т. 27. — № 6. — С. 12–19.
5. Kovács L., Labádi K., Sipos K. Synthesis and Properties of Polymer Metal Complexes of Polygalacturonic Acid: A Comprehensive Review // International Journal of Polymer Science. — 2025. — Art. 4216357.
6. Li D.-q., Xu F., Chen Sh. The role of surface functional groups of pectin and pectin-based materials on the adsorption of heavy metal ions and dyes // Carbohydrate Polymers. — 2022. DOI: 10.1016/j.carbpol.2021.118789
7. Minzanova S.T., Arkhipova D., Khabibullina A., Mironova L.G., Voloshina A.D., Sapunova A.S., Kulik N.V., Milyukov V.A., Mironov V.F. Synthesis of the new sodium pectinate metal complexes with cobalt and nickel ions and their antimicrobial activity // Doklady Akademii nauk. — 2019. — Vol. 487(5). — P. 511–514. DOI: 10.31857/S0869-56524875511-514
8. Meychik N., Nikolaeva Y., Kushunina M., Yermakov I. Are the carboxyl groups of pectin polymers the only metal-binding sites in plant cell walls? // Plant and Soil. — 2014. — Vol. 381 (1/2). — Pp. 25–34
9. Noor N., Shah A., Gani A., Gani A., Jhan F., Ashraf Z., Ahmad Ashwar B., Ganaie T. A. Pectin // Food biopolymers: Structural, functional and nutraceutical properties. — 2021. DOI: 10.1007/978-3-030-27061-2_6
10. Platplat S., Thielemans W. Chemical modification of pectin and polygalacturonic acid: A critical review // BioResources. — 2021. — Vol. 16. —  No. 4. — P. 8440–8475.
11. Ranga S., Patel S., Kumar M. Antimicrobial Agents Based on Metal Complexes: A Review on Recent Advances // Bioinorganic Chemistry and Applications. — 2022. — Art. 9754840.
12. Simoes M., Santos C., Ferreira C. The Antimicrobial Efficacy of Copper Complexes: A Review // Antibiotics. — 2025. — Vol. 14. — No. 5. — P. 516.
13. Szentmihályi K., Kótai L., Vinkler P., Sandor Z. Metal complex of polygalacturonic acid and its production / Patent. P 03 02501. — 2003. DOI: 10.13140/RG.2.1.3913.4160

References:

1. Rashidova S.Sh., Semenova L.N., Mirsagatova D.A. [Technological features of complex processing of lemon variety "Ylangoch"] // New achievements in chemistry and chemical technology of plant raw materials. — Barnaul, 2002. — P. 281–285. (In Russ.) 
2. Khaydarov S.Kh., Mukhidinov Z.K. [Study of the feature of periodate oxidation of carboxymethylcellulose and polygalacturonic acid] // Izvestiya Akademii nauk Respubliki Tadzhikistan. — 2023. — No. 2 (181). — P. 45–53. (In Russ.) 
3. Khalikov D.Kh., Mirzoyeva R.S., Bobojonova G.N. [Sorption activity of pectin polysaccharides concerning metal ions] // Doklady Akademii nauk Respubliki Tadzhikistan. — 2017. — Vol. 60. — No. 7–8. — P. 333–341. (In Russ.) 
4. Yusupova Yu.A., Khodjaeva S.A., Mukhidinov Z.K. [Anti-tumor activity of cobalt-containing complexes of potassium and sodium polygalacturonates and pharmacological compositions based on them] // Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii. — 2024. — Vol. 27. — No. 6. — P. 12–19. (In Russ.) 
5. Kovács L., Labádi K., Sipos K. [Synthesis and properties of polymer metal complexes of polygalacturonic acid: a comprehensive review] // International Journal of Polymer Science. — 2025. — Art. 4216357. 
6. Li D.-q., Xu F., Chen Sh. [The role of surface functional groups of pectin and pectin-based materials on the adsorption of heavy metal ions and dyes] // Carbohydrate Polymers. — 2022. DOI: 10.1016/j.carbpol.2021.118789 
7. Minzanova S.T., Arkhipova D., Khabibullina A., Mironova L.G., Voloshina A.D., Sapunova A.S., Kulik N.V., Milyukov V.A., Mironov V.F. [Synthesis of the new sodium pectinate metal complexes with cobalt and nickel ions and their antimicrobial activity] // Doklady Akademii nauk. — 2019. — Vol. 487(5). — P. 511–514. DOI: 10.31857/S0869-56524875511-514 
8. Meychik N., Nikolaeva Y., Kushunina M., Yermakov I. [Are the carboxyl groups of pectin polymers the only metal-binding sites in plant cell walls?] // Plant and Soil. — 2014. — Vol. 381 (1/2). — Pp. 25–34. 
9. Noor N., Shah A., Gani A., Gani A., Jhan F., Ashraf Z., Ahmad Ashwar B., Ganaie T. A. [Pectin] // Food biopolymers: Structural, functional and nutraceutical properties. — 2021. DOI: 10.1007/978-3-030-27061-2_6 
10. Platplat S., Thielemans W. [Chemical modification of pectin and polygalacturonic acid: a critical review] // BioResources. — 2021. — Vol. 16. — No. 4. — P. 8440–8475. 
11. Ranga S., Patel S., Kumar M. [Antimicrobial agents based on metal complexes: a review on recent advances] // Bioinorganic Chemistry and Applications. — 2022. — Art. 9754840. 
12. Simoes M., Santos C., Ferreira C. [The antimicrobial efficacy of copper complexes: a review] // Antibiotics. — 2025. — Vol. 14. — No. 5. — P. 516. 
13. Szentmihályi K., Kótai L., Vinkler P., Sandor Z. [Metal complex of polygalacturonic acid and its production] // Patent. P 03 02501. — 2003. DOI: 10.13140/RG.2.1.3913.4160.