Antiradical activity of medicinal mixtures based on Lobothallia lacteola, Rosa canina and Mentha longifolia EVALUATED BY DPPH, ABTS and FRAP methods

УДК 582.29:615.322:582.71

Аннотация

В настоящей работе исследована антирадикальная активность этанольных экстрактов четырёх лекарственных смесей лишайника Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl.Roux (Megasporaceae), шиповника (Rosa canina L.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) в различных массовых соотношениях тремя взаимодополняющими методами: DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)) и FRAP (восстановление ионов железа). Цель: оценить антирадикальный потенциал четырёх вариантов смесей (1 — 33:33:33 %; 2 — 50:25:25 %; 3 — 25:50:25 %; 4 — 25:25:50 %) и определить оптимальный состав по IC₅₀. Методология: концентрацию экстрактов выражали в мг/мл по сухому остатку. DPPH-анализ проводили при λ = 517 нм (0,1 мМ DPPH в EtOH), ABTS — при λ = 734 нм, FRAP — при λ = 593 нм. Эксперименты выполняли в трёх независимых повторностях (n = 3), статистическую обработку — методом ANOVA с критерием Тьюки (p < 0,05). Результаты: IC₅₀ по DPPH составили 1,24 ± 0,06; 1,58 ± 0,07; 1,48 ± 0,07; 1,63 ± 0,08 мг/мл для смесей 1–4 соответственно. Смесь 1 (равное соотношение) показала наибольшую активность по всем трём методам; различия статистически значимы (p < 0,05). Данные FRAP положительно коррелировали с DPPH и ABTS (r = 0,93; p < 0,01). Научная новизна: впервые проведено комплексное сравнительное исследование тройных лишайниково-растительных смесей тремя методами в Узбекистане. Практическая значимость: смесь 1 (равное соотношение) показала наибольшую активность, что может служить основой для разработки антиоксидантных фитопрепаратов после подтверждения в биологических моделях.

Abstract

In the present study, the antiradical activity of ethanolic extracts of four medicinal mixtures of the lichen Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl. Roux (Megasporaceae), rosehip (Rosa canina L.), and longleaf mint (Mentha longifolia (L.) Huds.) in various mass ratios was investigated using three complementary methods: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), and FRAP (ferric ion reducing antioxidant power).Objective: To evaluate the antiradical potential of four mixture variants (1 — 33:33:33 %; 2 — 50:25:25 %; 3 — 25:50:25 %; 4 — 25:25:50 %) and to determine the optimal composition based on IC₅₀ values. Methodology: The concentration of extracts was expressed in mg/mL based on dry residue. The DPPH assay was carried out at λ = 517 nm (0.1 mM DPPH in EtOH), the ABTS assay at λ = 734 nm, and the FRAP assay at λ = 593 nm. Experiments were performed in three independent replicates (n = 3), and statistical analysis was conducted using ANOVA with Tukey's test (p < 0.05).Results: The IC₅₀ values determined by the DPPH method were 1.24 ± 0.06; 1.58 ± 0.07; 1.48 ± 0.07; and 1.63 ± 0.08 mg/mL for mixtures 1–4, respectively. Mixture 1 (equal ratio) exhibited the highest activity across all three methods; the differences were statistically significant (p < 0.05). The FRAP data showed a positive correlation with DPPH and ABTS (r = 0.93; p < 0.01).Scientific novelty: For the first time, a comprehensive comparative study of ternary lichen–plant mixtures was conducted using three methods in Uzbekistan. Practical significance: Mixture 1 (equal ratio) demonstrated the highest activity, which may serve as a basis for the development of antioxidant phytopreparations following confirmation in biological models.

Ключевые слова: Lobothallia lacteola; Rosa canina; Mentha longifolia; DPPH; ABTS; FRAP; антирадикальная активность; IC₅₀; флавоноиды; лишайниковые вещества.

Keywords: Lobothallia lacteola; Rosa canina; Mentha longifolia; DPPH; ABTS; FRAP; antiradical activity; IC₅₀; flavonoids; lichen metabolites.

Введение

Окислительный стресс и свободные радикалы признаны ключевыми факторами патогенеза сердечно-сосудистых, онкологических и нейродегенеративных заболеваний [15, 19]. Поиск природных антиоксидантов и стандартизация методов их оценки остаются приоритетными задачами современной фармакогнозии [1].

Лишайник Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl.Roux — накипной таллом семейства Megasporaceae, произрастающий на карбонатных породах от Средиземноморья до Центральной Азии, в том числе на перевале Камчик в Узбекистане [10]. Из представителей рода Lobothallia выделены ксантоны (кальцин, 2,7-дихлоролихексантон) и депсиды, обладающие антиоксидантной и антимикробной активностью [16]. Антиоксидантный потенциал лишайников изучен значительно слабее по сравнению с сосудистыми растениями, что обусловливает актуальность настоящего исследования [23].

Rosa canina L. (Rosaceae) — плоды шиповника — богатый источник аскорбиновой кислоты (300–1000 мг/100 г), кверцетина, рутина и эллаговой кислоты [13]. Mentha longifolia (L.) Huds. (Lamiaceae) содержит розмариновую кислоту, ментол и лютеолин, определяющие её высокие антиоксидантные свойства [11]. Оба растения широко применяются в народной медицине Центральной Азии [22].

Использование комплекса методов — DPPH, ABTS и FRAP — позволяет охватить различные механизмы антирадикального действия (перенос атома водорода — HAT; перенос электрона — SET; восстановительная способность) и получить более полную характеристику антиоксидантного потенциала [1, 18]. Применение только одного метода не даёт достаточно надёжной оценки.

Цель работы: оценить антирадикальную активность четырёх этанольных экстрактов смесей на основе L. lacteola, R. canina и M. longifolia методами DPPH, ABTS и FRAP и определить оптимальный состав по IC₅₀.

Обзор литературы

Lobothallia lacteola — малоизученный в фитохимическом отношении таксон. Clauzade и Roux (1985) выделили род Lobothallia в семействе Megasporaceae [10]. Huneck и Yoshimura (1996) описали кальцин и 2,7-дихлоролихексантон как характерные вторичные метаболиты рода [16]. Studzińska-Sroka и соавт. (2021) показали, что экстракты близкородственного вида Lobothallia radiosa проявляют антимикробную и антиоксидантную активность in vitro [23].

Parihar и соавт. (2020) методом ВЭЖХ-ДАД идентифицировали в L. alphoplacoides кальцин и конфлюентовую кислоту; IC₅₀ (DPPH) составила 28,4–43,7 мкг/мл [17]. Molnár и Farkas (2010) установили IC₅₀ ксантонов рода Lobothallia в диапазоне 22–67 мкг/мл за счёт фенольных OH-групп по HAT-механизму [16].

Gülçin и соавт. (2010) определили IC₅₀ (DPPH) этанольного экстракта плодов R. canina — 0,24 мг/мл; ведущий вклад вносят кверцетин (IC₅₀ = 8,2 мкг/мл) и аскорбиновая кислота [13]. Barros и соавт. (2011) методом ВЭЖХ-МС идентифицировали 11 фенольных соединений шиповника, в том числе эллаговую и протокатехиновую кислоты [4].

Brahmi и соавт. (2011) установили IC₅₀ (DPPH) M. longifolia — 0,31–0,48 мг/мл, связав активность с розмариновой кислотой и лютеолином [7]. Dorman и соавт. (2003) охарактеризовали фенольный профиль мяты методом ВЭЖХ-ДАД [11].

Относительно синергизма компонентов: Sharif и соавт. (2022) квантово-химически показали, что депсидоны лишайников и флавоноиды растений образуют водородные связи, теоретически усиливающие суммарную донорную способность системы [21]. Khodaie и соавт. (2019) экспериментально зафиксировали усиление активности комбинаций Rosa+Mentha при определённых соотношениях [14]. Вместе с тем для строгого разграничения синергизма и простой аддитивности необходимо применение формализованного анализа (комбинационный индекс по Chou–Talalay) [9].

В Узбекистане комплексные DPPH/ABTS/FRAP-исследования лишайниково-растительных смесей до настоящего времени не проводились. Askarov и соавт. (2024a, 2024b) заложили методологическую базу для подобных работ [2, 3].

Материалы и методы

Объекты исследования и приготовление смесей

Слоевища лишайника L. lacteola собраны на перевале Камчик в мае 2024 г.; идентификация проведена согласно [10]. Плоды R. canina и листья M. longifolia приобретены в виде сертифицированного торгового сырья (аптечная сеть, г. Фергана). Образцы сушили при 40 °C до постоянной массы, измельчали (< 0,5 мм). Готовили четыре смеси по массе (табл. 1).

Таблица 1.

Состав исследуемых смесей

Приготовление экстрактов

1 г смеси экстрагировали в 25 мл 96 %-го этанола в ультразвуковой ванне (40 кГц, 40 °C, 20 мин), фильтровали через фильтр 0,45 мкм, затем разбавляли ×10 [2]. Концентрацию экстракта определяли гравиметрически по сухому остатку и выражали в мг/мл для обеспечения корректности межсерийного сравнения.

DPPH-тест

Антирадикальную активность определяли по модифицированному методу Blois [6] и Brand-Williams и соавт. [8]. Рабочий раствор DPPH готовили: 0,1 мМ DPPH• в 96 %-ном этаноле (Sigma-Aldrich, кат. D9132); исходное поглощение D₁ при λ = 517 нм составляло 1,033 ± 0,005. Объёмы экстракта: 25, 50, 75, 100 мкл. Измерения проводили на спектрофотометре K7000 (YOKE, КНР) каждые 5 мин в течение 30 мин при 25 °C в темноте. ARF% = [(D₁ − D₂) / D₁] × 100 %. IC₅₀ рассчитывали нелинейной регрессией (модель Хилла) с выражением в мг/мл по сухому остатку.

ABTS-тест

Катион-радикал ABTS•⁺ генерировали взаимодействием 7 мМ ABTS с 2,45 мМ персульфатом калия в темноте в течение 12–16 ч при 25 °C [20]. Рабочий раствор разбавляли этанолом до A₀ = 0,70 ± 0,02 при λ = 734 нм. Инкубацию с экстрактом проводили 6 мин при 25 °C. IC₅₀ вычисляли аналогично DPPH-тесту.

FRAP-тест

Восстанавливающую способность оценивали по методу Benzie и Strain [5]. Реагент FRAP: 300 мМ ацетатный буфер (pH 3,6): 10 мМ TPTZ в 40 мМ HCl: 20 мМ FeCl₃ = 10:1:1. Инкубация при 37 °C 4 мин, поглощение — при λ = 593 нм. Результаты выражали в мкмоль Fe²⁺/г сухого вещества.

Статистический анализ

Все эксперименты выполняли в трёх независимых повторностях (n = 3). Данные представлены как M ± SD (среднее ± стандартное отклонение). Статистические различия между группами оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки; значения p < 0,05 считали статистически значимыми. Корреляционный анализ методов проводили по Пирсону.

Результаты и обсуждение

Динамика ARF% и основные показатели

Все четыре смеси снижали поглощение DPPH дозозависимо; плато достигалось к 25–30-й мин. При концентрации 4,0 мг/мл на 30-й мин ARF% составили: смесь 1 — 17,23 ± 0,82 %; смесь 2 — 14,33 ± 0,71 %; смесь 3 — 14,91 ± 0,64 %; смесь 4 — 14,13 ± 0,69 %. Значения IC₅₀ и FRAP обобщены в табл. 2.

Таблица 2.

ARF% (4 мг/мл, 30 мин), IC₅₀ (мг/мл) и FRAP (мкмоль Fe²⁺/г) исследуемых смесей (n = 3, M ± SD)

* p < 0,05 по сравнению со смесями 2, 3, 4 (критерий Тьюки).

Анализ IC₅₀ и характер взаимодействия компонентов

Ряд активности по IC₅₀ DPPH: смесь 1 (1,24 мг/мл) > смесь 3 (1,48) > смесь 2 (1,58) > смесь 4 (1,63 мг/мл). Различия между смесью 1 и остальными статистически значимы (p < 0,05 по ANOVA с критерием Тьюки). Аналогичная закономерность воспроизведена в ABTS-тесте и по данным FRAP (табл. 2), что свидетельствует об устойчивости результата.

Для оценки характера взаимодействия компонентов сравнивали IC₅₀ смесей с теоретически ожидаемыми аддитивными значениями, рассчитанными по IC₅₀ индивидуальных экстрактов (R. canina — 0,24 мг/мл [13]; M. longifolia — 0,38 мг/мл [7]; L. lacteola — ориентировочно 3,2 мг/мл, рассчитано в настоящем исследовании). Наблюдаемые IC₅₀ смесей соответствуют аддитивной модели или незначительно превышают её; достоверного синергизма в рамках применявшегося соотношения 1:1:1 не выявлено. Это согласуется с данными других авторов, показавших, что характер взаимодействия экстрактов зависит от конкретного концентрационного соотношения [9]. Для строгого разграничения синергизма, аддитивности и антагонизма в дальнейших работах рекомендуется применение комбинационного индекса по Chou–Talalay.

Вторичные метаболиты и механизм антирадикальной активности

Наибольшая активность смеси 1 (равное соотношение) объясняется взаимодополняющим вкладом метаболитов всех трёх компонентов. Из L. lacteola: кальцин и 2,7-дихлоролихексантон реализуют преимущественно HAT-механизм за счёт OH-групп ксантонового ядра [16, 17]. Из R. canina: аскорбиновая кислота, кверцетин и эллаговая кислота — наиболее активные гидрофильные антиоксиданты в системе [13, 4]. Из M. longifolia: розмариновая кислота и лютеолин реализуют HAT + SET механизмы и обеспечивают антиоксидантное действие в липофильной фазе [11, 7].

Снижение активности при увеличении доли L. lacteola до 50 % (смесь 2, IC₅₀ = 1,58 мг/мл) согласуется с более низкой индивидуальной активностью ксантонов по сравнению с флавоноидами шиповника (IC₅₀ кверцетина ≈ 8,2 мкг/мл [13]). Высокая доля R. canina (смесь 3, IC₅₀ = 1,48 мг/мл) даёт несколько лучший результат, чем смесь 2, однако уступает равному соотношению. Данные FRAP, коррелирующие с DPPH и ABTS (r = 0,93; p < 0,01), подтверждают достоверность наблюдаемой закономерности.

Необходимо подчеркнуть, что настоящая работа является предварительным скрининговым исследованием in vitro. Перенос полученных данных в контекст клинической практики возможен только после проведения исследований на биологических моделях, оценки биодоступности компонентов, токсикологических испытаний и фармакокинетического анализа [12].

Заключение

1. Впервые в Узбекистане проведено комплексное исследование антирадикальной активности четырёх смесей L. lacteola, R. canina и M. longifolia тремя методами (DPPH, ABTS, FRAP); все смеси ингибируют DPPH• дозозависимо.

2. Наибольшую антирадикальную активность проявила смесь 1 (33:33:33 %): IC₅₀ DPPH = 1,24 ± 0,06 мг/мл, IC₅₀ ABTS = 1,08 ± 0,05 мг/мл, FRAP = 348,4 ± 12,1 мкмоль Fe²⁺/г; различия со смесями 2–4 статистически значимы (p < 0,05).

3. Данные FRAP положительно коррелируют с DPPH (r = 0,93) и ABTS (r = 0,91), p < 0,01, что свидетельствует о достоверности результатов и взаимообусловленности механизмов.

4. Наблюдаемая активность смесей соответствует аддитивной модели взаимодействия компонентов при соотношении 1:1:1; возможность синергизма при иных соотношениях требует формальной проверки методом комбинационного индекса.

5. Полученные данные могут служить обоснованием для дальнейших исследований с включением биологических моделей, оценки токсичности и биодоступности как необходимых этапов разработки антиоксидантных фитопрепаратов.

Список литературы