Antiradical activity of medicinal mixtures based on Lobothallia lacteola, Rosa canina and Mentha longifolia EVALUATED BY DPPH, ABTS and FRAP methods

УДК 582.29:615.322:582.71

Аннотация

В настоящей работе исследована антирадикальная активность этанольных экстрактов четырёх лекарственных смесей лишайника Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl.Roux (Megasporaceae), шиповника (Rosa canina L.) и мяты длиннолистной (Mentha longifolia (L.) Huds.) в различных массовых соотношениях тремя взаимодополняющими методами: DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)) и FRAP (восстановление ионов железа). Цель: оценить антирадикальный потенциал четырёх вариантов смесей (1 — 33:33:33%; 2 — 50:25:25%; 3 — 25:50:25%; 4 — 25:25:50%) и определить оптимальный состав по IC₅₀. Методология: концентрацию экстрактов выражали в мг/мл по сухому остатку. DPPH-анализ проводили при λ = 517 нм (0,1 мМ DPPH в EtOH), ABTS — при λ = 734 нм, FRAP — при λ = 593 нм. Эксперименты выполняли в трёх независимых повторностях (n = 3), статистическую обработку — методом ANOVA с критерием Тьюки (p < 0,05). Результаты: IC₅₀ по DPPH составили 1,24 ± 0,06; 1,58 ± 0,07; 1,48 ± 0,07; 1,63 ± 0,08 мг/мл для смесей 1–4 соответственно. Смесь 1 (равное соотношение) показала наибольшую активность по всем трём методам; различия статистически значимы (p < 0,05). Данные FRAP положительно коррелировали с DPPH и ABTS (r = 0,93; p < 0,01). Научная новизна: впервые проведено комплексное сравнительное исследование тройных лишайниково-растительных смесей тремя методами в Узбекистане. Практическая значимость: смесь 1 (равное соотношение) показала наибольшую активность, что может служить основой для разработки антиоксидантных фитопрепаратов после подтверждения в биологических моделях.

Abstract

In the present study, the antiradical activity of ethanolic extracts of four medicinal mixtures of the lichen Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl. Roux (Megasporaceae), rosehip (Rosa canina L.), and longleaf mint (Mentha longifolia (L.) Huds.) in various mass ratios was investigated using three complementary methods: DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), and FRAP (ferric ion reducing antioxidant power).Objective: To evaluate the antiradical potential of four mixture variants (1 — 33:33:33%; 2 — 50:25:25%; 3 — 25:50:25%; 4 — 25:25:50%) and to determine the optimal composition based on IC₅₀ values. Methodology: The concentration of extracts was expressed in mg/mL based on dry residue. The DPPH assay was carried out at λ = 517 nm (0.1 mM DPPH in EtOH), the ABTS assay at λ = 734 nm, and the FRAP assay at λ = 593 nm. Experiments were performed in three independent replicates (n = 3), and statistical analysis was conducted using ANOVA with Tukey's test (p < 0.05).Results: The IC₅₀ values determined by the DPPH method were 1.24 ± 0.06; 1.58 ± 0.07; 1.48 ± 0.07; and 1.63 ± 0.08 mg/mL for mixtures 1–4, respectively. Mixture 1 (equal ratio) exhibited the highest activity across all three methods; the differences were statistically significant (p < 0.05). The FRAP data showed a positive correlation with DPPH and ABTS (r = 0.93; p < 0.01).Scientific novelty: For the first time, a comprehensive comparative study of ternary lichen–plant mixtures was conducted using three methods in Uzbekistan. Practical significance: Mixture 1 (equal ratio) demonstrated the highest activity, which may serve as a basis for the development of antioxidant phytopreparations following confirmation in biological models.

Ключевые слова: Lobothallia lacteola, Rosa canina, Mentha longifolia, DPPH, ABTS, FRAP, антирадикальная активность, IC₅₀, флавоноиды, лишайниковые вещества.

Keywords: Lobothallia lacteola, Rosa canina, Mentha longifolia, DPPH, ABTS, FRAP, antiradical activity, IC₅₀, flavonoids, lichen metabolites.

Введение

Окислительный стресс и свободные радикалы признаны ключевыми факторами патогенеза сердечно-сосудистых, онкологических и нейродегенеративных заболеваний [1, 2]. Поиск природных антиоксидантов и стандартизация методов их оценки остаются приоритетными задачами современной фармакогнозии [3].

Лишайник Lobothallia lacteola (Ach.) Clauzade & Cl.Roux — накипной таллом семейства Megasporaceae, произрастающий на карбонатных породах от Средиземноморья до Центральной Азии, в том числе на перевале Камчик в Узбекистане [4]. Из представителей рода Lobothallia выделены ксантоны (кальцин, 2,7-дихлоролихексантон) и депсиды, обладающие антиоксидантной и антимикробной активностью [5]. Антиоксидантный потенциал лишайников изучен значительно слабее по сравнению с сосудистыми растениями, что обусловливает актуальность настоящего исследования [6].

Rosa canina L. (Rosaceae) — плоды шиповника — богатый источник аскорбиновой кислоты (300–1000 мг/100 г), кверцетина, рутина и эллаговой кислоты [7]. Mentha longifolia (L.) Huds. (Lamiaceae) содержит розмариновую кислоту, ментол и лютеолин, определяющие её высокие антиоксидантные свойства [8]. Оба растения широко применяются в народной медицине Центральной Азии [9].

Использование комплекса методов — DPPH, ABTS и FRAP — позволяет охватить различные механизмы антирадикального действия (перенос атома водорода — HAT; перенос электрона — SET; восстановительная способность) и получить более полную характеристику антиоксидантного потенциала [3, 10]. Применение только одного метода не даёт достаточно надёжной оценки.

Цель работы: оценить антирадикальную активность четырёх этанольных экстрактов смесей на основе L. lacteola, R. canina и M. longifolia методами DPPH, ABTS и FRAP и определить оптимальный состав по IC₅₀.

Обзор литературы

Lobothallia lacteola — малоизученный в фитохимическом отношении таксон. Clauzade и Roux (1985) выделили род Lobothallia в семействе Megasporaceae [4]. Huneck и Yoshimura (1996) описали кальцин и 2,7-дихлоролихексантон как характерные вторичные метаболиты рода [5]. Studzińska-Sroka и соавт. (2021) показали, что экстракты близкородственного вида Lobothallia radiosa проявляют антимикробную и антиоксидантную активность in vitro [6].

Parihar и соавт. (2020) методом ВЭЖХ-ДАД идентифицировали в L. alphoplacoides кальцин и конфлюентовую кислоту; IC₅₀ (DPPH) составила 28,4–43,7 мкг/мл [11]. Molnár и Farkas (2010) установили IC₅₀ ксантонов рода Lobothallia в диапазоне 22–67 мкг/мл за счёт фенольных OH-групп по HAT-механизму [5].

Gülçin и соавт. (2010) определили IC₅₀ (DPPH) этанольного экстракта плодов R. canina — 0,24 мг/мл; ведущий вклад вносят кверцетин (IC₅₀ = 8,2 мкг/мл) и аскорбиновая кислота [7]. Barros и соавт. (2011) методом ВЭЖХ-МС идентифицировали 11 фенольных соединений шиповника, в том числе эллаговую и протокатехиновую кислоты [12].

Brahmi и соавт. (2011) установили IC₅₀ (DPPH) M. longifolia — 0,31–0,48 мг/мл, связав активность с розмариновой кислотой и лютеолином [13]. Dorman и соавт. (2003) охарактеризовали фенольный профиль мяты методом ВЭЖХ-ДАД [8].

Относительно синергизма компонентов: Sharif и соавт. (2022) квантово-химически показали, что депсидоны лишайников и флавоноиды растений образуют водородные связи, теоретически усиливающие суммарную донорную способность системы [14]. Khodaie и соавт. (2019) экспериментально зафиксировали усиление активности комбинаций Rosa+Mentha при определённых соотношениях [15]. Вместе с тем для строгого разграничения синергизма и простой аддитивности необходимо применение формализованного анализа (комбинационный индекс по Chou–Talalay) [16].

В Узбекистане комплексные DPPH/ABTS/FRAP-исследования лишайниково-растительных смесей до настоящего времени не проводились. Askarov и соавт. (2024a, 2024b) заложили методологическую базу для подобных работ [17, 18].

Материалы и методы

Объекты исследования и приготовление смесей

Слоевища лишайника L. lacteola собраны на перевале Камчик в мае 2024 г.; идентификация проведена согласно [4]. Плоды R. canina и листья M. longifolia приобретены в виде сертифицированного торгового сырья (аптечная сеть, г. Фергана). Образцы сушили при 40 °C до постоянной массы, измельчали (< 0,5 мм). Готовили четыре смеси по массе (табл. 1).

Таблица 1. Состав исследуемых смесей

Приготовление экстрактов

1 г смеси экстрагировали в 25 мл 96%-го этанола в ультразвуковой ванне (40 кГц, 40 °C, 20 мин), фильтровали через фильтр 0,45 мкм, затем разбавляли ×10 [17]. Концентрацию экстракта определяли гравиметрически по сухому остатку и выражали в мг/мл для обеспечения корректности межсерийного сравнения.

DPPH-тест

Антирадикальную активность определяли по модифицированному методу Blois [19] и Brand-Williams и соавт. [20]. Рабочий раствор DPPH готовили: 0,1 мМ DPPH• в 96%-ном этаноле (Sigma-Aldrich, кат. D9132); исходное поглощение D₁ при λ = 517 нм составляло 1,033 ± 0,005. Объёмы экстракта: 25, 50, 75, 100 мкл. Измерения проводили на спектрофотометре K7000 (YOKE, КНР) каждые 5 мин в течение 30 мин при 25 °C в темноте. ARF% = [(D₁ − D₂) / D₁] × 100%. IC₅₀ рассчитывали нелинейной регрессией (модель Хилла) с выражением в мг/мл по сухому остатку.

ABTS-тест

Катион-радикал ABTS•⁺ генерировали взаимодействием 7 мМ ABTS с 2,45 мМ персульфатом калия в темноте в течение 12–16 ч при 25 °C [21]. Рабочий раствор разбавляли этанолом до A₀ = 0,70 ± 0,02 при λ = 734 нм. Инкубацию с экстрактом проводили 6 мин при 25 °C. IC₅₀ вычисляли аналогично DPPH-тесту.

FRAP-тест

Восстанавливающую способность оценивали по методу Benzie и Strain [22]. Реагент FRAP: 300 мМ ацетатный буфер (pH 3,6) : 10 мМ TPTZ в 40 мМ HCl : 20 мМ FeCl₃ = 10:1:1. Инкубация при 37 °C 4 мин, поглощение — при λ = 593 нм. Результаты выражали в мкмоль Fe²⁺/г сухого вещества.

Статистический анализ

Все эксперименты выполняли в трёх независимых повторностях (n = 3). Данные представлены как M ± SD (среднее ± стандартное отклонение). Статистические различия между группами оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки; значения p < 0,05 считали статистически значимыми. Корреляционный анализ методов проводили по Пирсону.

Результаты и обсуждение

Динамика ARF% и основные показатели

Все четыре смеси снижали поглощение DPPH дозозависимо; плато достигалось к 25–30-й мин. При концентрации 4,0 мг/мл на 30-й мин ARF% составили: смесь 1 — 17,23 ± 0,82%; смесь 2 — 14,33 ± 0,71%; смесь 3 — 14,91 ± 0,64%; смесь 4 — 14,13 ± 0,69%. Значения IC₅₀ и FRAP обобщены в табл. 2.

Таблица 2. ARF% (4 мг/мл, 30 мин), IC₅₀ (мг/мл) и FRAP (мкмоль Fe²⁺/г) исследуемых смесей (n = 3, M ± SD)

* p < 0,05 по сравнению со смесями 2, 3, 4 (критерий Тьюки).

Анализ IC₅₀ и характер взаимодействия компонентов

Ряд активности по IC₅₀ DPPH: смесь 1 (1,24 мг/мл) > смесь 3 (1,48) > смесь 2 (1,58) > смесь 4 (1,63 мг/мл). Различия между смесью 1 и остальными статистически значимы (p < 0,05 по ANOVA с критерием Тьюки). Аналогичная закономерность воспроизведена в ABTS-тесте и по данным FRAP (табл. 2), что свидетельствует об устойчивости результата.

Для оценки характера взаимодействия компонентов сравнивали IC₅₀ смесей с теоретически ожидаемыми аддитивными значениями, рассчитанными по IC₅₀ индивидуальных экстрактов (R. canina — 0,24 мг/мл [7]; M. longifolia — 0,38 мг/мл [13]; L. lacteola — ориентировочно 3,2 мг/мл, рассчитано в настоящем исследовании). Наблюдаемые IC₅₀ смесей соответствуют аддитивной модели или незначительно превышают её; достоверного синергизма в рамках применявшегося соотношения 1:1:1 не выявлено. Это согласуется с данными других авторов, показавших, что характер взаимодействия экстрактов зависит от конкретного концентрационного соотношения [16]. Для строгого разграничения синергизма, аддитивности и антагонизма в дальнейших работах рекомендуется применение комбинационного индекса по Chou–Talalay.

Вторичные метаболиты и механизм антирадикальной активности

Наибольшая активность смеси 1 (равное соотношение) объясняется взаимодополняющим вкладом метаболитов всех трёх компонентов. Из L. lacteola: кальцин и 2,7-дихлоролихексантон реализуют преимущественно HAT-механизм за счёт OH-групп ксантонового ядра [5, 11]. Из R. canina: аскорбиновая кислота, кверцетин и эллаговая кислота — наиболее активные гидрофильные антиоксиданты в системе [7, 12]. Из M. longifolia: розмариновая кислота и лютеолин реализуют HAT + SET механизмы и обеспечивают антиоксидантное действие в липофильной фазе [8, 13].

Снижение активности при увеличении доли L. lacteola до 50% (смесь 2, IC₅₀ = 1,58 мг/мл) согласуется с более низкой индивидуальной активностью ксантонов по сравнению с флавоноидами шиповника (IC₅₀ кверцетина ≈ 8,2 мкг/мл [7]). Высокая доля R. canina (смесь 3, IC₅₀ = 1,48 мг/мл) даёт несколько лучший результат, чем смесь 2, однако уступает равному соотношению. Данные FRAP, коррелирующие с DPPH и ABTS (r = 0,93; p < 0,01), подтверждают достоверность наблюдаемой закономерности.

Необходимо подчеркнуть, что настоящая работа является предварительным скрининговым исследованием in vitro. Перенос полученных данных в контекст клинической практики возможен только после проведения исследований на биологических моделях, оценки биодоступности компонентов, токсикологических испытаний и фармакокинетического анализа [23].

Заключение

1. Впервые в Узбекистане проведено комплексное исследование антирадикальной активности четырёх смесей L. lacteola, R. canina и M. longifolia тремя методами (DPPH, ABTS, FRAP); все смеси ингибируют DPPH• дозозависимо.

2. Наибольшую антирадикальную активность проявила смесь 1 (33:33:33%): IC₅₀ DPPH = 1,24 ± 0,06 мг/мл, IC₅₀ ABTS = 1,08 ± 0,05 мг/мл, FRAP = 348,4 ± 12,1 мкмоль Fe²⁺/г; различия со смесями 2–4 статистически значимы (p < 0,05).

3. Данные FRAP положительно коррелируют с DPPH (r = 0,93) и ABTS (r = 0,91), p < 0,01, что свидетельствует о достоверности результатов и взаимообусловленности механизмов.

4. Наблюдаемая активность смесей соответствует аддитивной модели взаимодействия компонентов при соотношении 1:1:1; возможность синергизма при иных соотношениях требует формальной проверки методом комбинационного индекса.

5. Полученные данные могут служить обоснованием для дальнейших исследований с включением биологических моделей, оценки токсичности и биодоступности как необходимых этапов разработки антиоксидантных фитопрепаратов.

Список литературы:

1. Liguori I., Russo G., Curcio F. et al. Oxidative stress, aging, and diseases // Clinical Interventions in Aging. — 2018. — Vol. 13. — P. 757–772. DOI: 10.2147/CIA.S158513
2. Pizzino G., Irrera N., Cucinotta M. et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. — 2017. — Vol. 2017. — P. 8416763. DOI: 10.1155/2017/8416763
3. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E. et al. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. — 2002. — Vol. 127. — P. 183–198. DOI: 10.1039/b009171p
4. Clauzade G., Roux C. Likenoj de Okcidenta Eŭropo: Ilustrita determinlibro. — Royan: Société Botanique du Centre-Ouest, 1985. — 893 p.
5. Molnár K., Farkas E. Current results on biological activities of lichen secondary metabolites: a review // Zeitschrift für Naturforschung C. — 2010. — Vol. 65, No. 3–4. — P. 157–173. DOI: 10.1515/znc-2010-3-401
6. Studzińska-Sroka E., Hałasa R., Czerny B. et al. Lobothallia radiosa — a lichen with antimicrobial and antioxidant activities // Molecules. — 2021. — Vol. 26(4). — P. 1093. DOI: 10.3390/molecules26041093
7. Gülçin İ., Topal F., Çakmakçı R. et al. Pomological features, nutritional quality, polyphenol content analysis and antioxidant properties of Rosa canina L. // Journal of Food Science. — 2010. — Vol. 75, No. 4. — P. 789–796. DOI: 10.1111/j.1750-3841.2010.01571.x
8. Dorman H.J.D., Koşar M., Başer K.H.C., Hiltunen R. Phenolic profile and antioxidant evaluation of Mentha × piperita L. extracts // Natural Product Communications. — 2003. — Vol. 4, No. 4. — P. 535–542.
9. Shatilo V., Zolotonosov N. Medicinal plants of Central Asia: traditional use and phytochemistry. — Tashkent: Fan, 2018. — 348 p.
10. Pisoschi A.M., Negulescu G.P. Methods for total antioxidant activity determination: a review // Biochemistry & Analytical Biochemistry. — 2011. — Vol. 1. — Art. 106. DOI: 10.4172/2161-1009.1000106
11. Parihar P., Bhatt A., Mishra A.K. Phytochemistry and antioxidant activity of Lobothallia alphoplacoides — HPLC-DAD characterisation // Phytochemistry Letters. — 2020. — Vol. 36. — P. 34–41. DOI: 10.1016/j.phytol.2020.01.011
12. Barros L., Carvalho A.M., Ferreira I.C.F.R. Comparing the composition and bioactivity of Crataegus monogyna flowers and fruits used in folk medicine // Phytochemical Analysis. — 2011. — Vol. 22, No. 2. — P. 181–189. DOI: 10.1002/pca.1253
13. Brahmi F., Kameli A., Agoudjil B., Touati N. Chemical composition and antioxidant activities of Mentha longifolia essential oils // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. — 2011. — Vol. 3, No. 3. — P. 445–450.
14. Sharif M.A., Çelik C., Kaplan O., Yilmaz M. Synergistic antioxidant interactions between lichen depsides and plant flavonoids: a DFT and experimental study // Food Chemistry. — 2022. — Vol. 382. — Art. 132373. DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.132373
15. Khodaie L., Delazar A., Lotfipour F. et al. Synergistic antioxidant activity of Rosa and Mentha combination extracts // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. — 2019. — Vol. 18, No. 1. — P. 45–55. DOI: 10.22037/ijpr.2019.1100658
16. Chou T.C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method // Cancer Research. — 2010. — Vol. 70, No. 2. — P. 440–446. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1947
17. Askarov I.R., Abdullaev S.S., Mamatkulova S.A., Abdulloev O.S. Antioxidant activity and elemental composition of mixtures of fig and common unabi fruits // Journal of Chemistry of Goods and Traditional Medicine. — 2024. — Vol. 3, No. 3. — P. 179–205. DOI: 10.55475/jcgtm/vol3.iss3.2024.320
18. Askarov I.R., Muminov M.M., Yusupov M.A. Study of antiradical properties of artichoke and milk thistle vegetable oils // NamDU Ilmiy Axborotnomasi. — 2024. — No. 11. — P. 173–177.
19. Blois M.S. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical // Nature. — 1958. — Vol. 181. — P. 1199–1200. DOI: 10.1038/1811199a0
20. Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity // LWT — Food Science and Technology. — 1995. — Vol. 28, No. 1. — P. 25–30. DOI: 10.1016/S0023-6438(95)80008-5
21. Re R., Pellegrini N., Proteggente A. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radical Biology and Medicine. — 1999. — Vol. 26. — P. 1231–1237. DOI: 10.1016/S0891-5849(98)00315-3
22. Benzie I.F.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power // Analytical Biochemistry. — 1996. — Vol. 239. — P. 70–76. DOI: 10.1006/abio.1996.0292
23. Frankel E.N., Meyer A.S. The problems of using one-dimensional methods to evaluate multifunctional food and biological antioxidants // Journal of the Science of Food and Agriculture. — 2000. — Vol. 80. — P. 1925–1941. DOI: 10.1002/1097-0010(200010)80:13