AMINO ACID PROFILE OF THE LICHEN Lecanora rupicola (Rupicolaceae) FROM THE KAMCHIK PASS (UZBEKISTAN): A PRIMARY HPLC STUDY AND PHARMACOLOGICAL POTENTIAL

УДК 582.29:577.16

Аннотация

Впервые определён аминокислотный профиль лишайника Lecanora rupicola (Rupicolaceae), произрастающего на перевале Камчик (Узбекистан, 41°02′ с.ш., 70°03′ в.д., ~2250 м н.у.м.), в условиях высокогорного климата с резкими перепадами температур и интенсивным УФ-излучением. Цель работы: количественная идентификация свободных аминокислот методом ВЭЖХ и оценка биологического и фармакологического потенциала исследуемого вида.

Методы. Свободные аминокислоты выделяли осаждением белков 20%-м раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУК) с последующей лиофильной сушкой супернатанта и ПТК-дериватизацией фенилизотиоцианатом (ФИТЦ). Анализ проводили на хроматографе Agilent Technologies 1200 (DAD-детектор, λ = 269 нм) с колонкой Discovery HS C18 (75 × 4,6 мм, 5 мкм) в изократическом режиме (подвижные фазы: A — 0,14 М CH₃COONa + 0,05% триэтиламина, pH 6,4; Б — ацетонитрил; скорость потока 1,2 мл/мин). Каждый образец анализировали в пяти повторностях (n = 5). Результаты обрабатывали методом описательной статистики (M ± SD, CV%).

Результаты. В экстракте идентифицировано 20 аминокислот; суммарное содержание составило 15,647 ± 0,231 мг/г сухого вещества (CV < 3% для всех компонентов). Доминирующими аминокислотами являются глутамин (2,311 мг/г; 14,8%) и триптофан (1,814 мг/г; 11,6%), что достоверно превышает средние значения для аналогичных видов в литературе (p < 0,05). Суммарное содержание незаменимых аминокислот составило 7,270 мг/г (46,5% от общего количества).

Научная новизна. Настоящая работа представляет первое систематическое ВЭЖХ-исследование аминокислотного состава L. rupicola из Центральной Азии. Установлено, что вид отличается необычно высоким содержанием триптофана, что может быть связано с усиленным биосинтезом индольных соединений в условиях стресса. Сравнение с опубликованными данными по 12 видам рода Lecanora указывает на уникальность аминокислотного профиля перевала Камчик.

Abstract

For the first time, the amino acid profile of the lichen Lecanora rupicola (Rupicolaceae) from the Kamchik Pass (Uzbekistan, ~2250 m a.s.l.) has been determined. Objective: to quantitatively identify free amino acids by HPLC and assess the biological and pharmacological potential of the species. Methods: free amino acids were isolated using 20% TCA protein precipitation, lyophilisation, and PTC derivatisation with PITC. Analysis was performed on an Agilent 1200 HPLC system (DAD, 269 nm; Discovery HS C18, 75 × 4.6 mm; isocratic mode; n = 5 replicates). Results: 20 amino acids were identified; total content 15.647 ± 0.231 mg/g dry weight (CV < 3%). Glutamine (2.311 mg/g; 14.8%) and tryptophan (1.814 mg/g; 11.6%) predominated. Total essential amino acid content: 7.270 mg/g (46.5%). Novelty: this is the first systematic HPLC study of L. rupicola amino acids from Central Asia, revealing an unusually high tryptophan content linked to stress-induced indole biosynthesis.

Ключевые слова: Lecanora rupicola, лишайник, аминокислоты, ВЭЖХ, ПТК-дериватизация, глутамин, триптофан, незаменимые аминокислоты, фармакологический потенциал, перевал Камчик, Узбекистан.

Keywords: Lecanora rupicola, lichen, amino acids, HPLC, PTC derivatisation, glutamine, tryptophan, essential amino acids, pharmacological potential, Kamchik Pass, Uzbekistan.

1. Введение

Лишайники как симбиотические организмы, обитающие в экстремальных местообитаниях, вырабатывают богатый арсенал биологически активных вторичных метаболитов: усниновую кислоту, атранорин, лихестериновые кислоты, полисахариды и аминокислоты [1, 11]. В последние годы интерес к лихенологическим биоактивным соединениям резко возрос в контексте поиска новых антибиотических, антиоксидантных и цитотоксических агентов [3, 12].

Свободные аминокислоты являются ключевыми биомаркерами экологической адаптации растений и лишайников к стрессовым условиям: засухе, перепадам температур, УФ-излучению и дефициту питательных веществ [2, 7]. Накопление протекторных аминокислот — в особенности глутамина, пролина и цистеина — представляет собой универсальный ответ на абиотические стрессы [13]. Тем не менее систематические данные по аминокислотному профилю большинства видов рода Lecanora до сих пор отсутствуют.

Вид Lecanora rupicola (Huds.) Zahlbr. (сем. Rupicolaceae) — широко распространённый накипной лишайник, колонизирующий силикатные горные породы от умеренных до альпийских зон [4, 14]. На территории Узбекистана данный вид описан в горах Тянь-Шаня [15], однако его биохимический состав в условиях Центральной Азии до настоящего времени не изучался. Перевал Камчик (41°02′ с.ш., 70°03′ в.д., высота ~2250 м н.у.м.) характеризуется экстремальным климатом: среднегодовая амплитуда температур превышает 40 °C, годовой уровень УФ-излучения на 25–30% выше, чем на равнинах Ферганской долины [16].

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с предколоночной ПТК-дериватизацией по Bidlingmeyer [8] является «золотым стандартом» количественного определения аминокислот в биологических матрицах, обеспечивая воспроизводимость CV < 3% и предел обнаружения < 1 пмоль на инъекцию [17].

Цель настоящей работы: впервые провести полное ВЭЖХ-определение свободных аминокислот в экстракте L. rupicola с перевала Камчик (Узбекистан), выполнить статистическую обработку результатов, сравнить полученный профиль с данными для других видов лишайников и оценить фармакологический потенциал данного вида.

2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования и сбор образцов

Слоевища лишайника Lecanora rupicola собирали в мае 2024 года на северо-восточном склоне перевала Камчик (41°02′17″ с.ш., 70°03′45″ в.д., высота 2247 м н.у.м.) в трёх точках с интервалом 200 м. Видовая принадлежность верифицирована по морфологическим признакам [4] и по тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей A (толуол — диэтиловый эфир — уксусная кислота, 185:45:10) в соответствии с ключом Huneck & Yoshimura [5]. Гербарные образцы хранятся на кафедре пищевых технологий Международного института пищевых технологий и инженерии (г. Фергана). С каждой точки отобрано по три образца (n = 9 образцов). Образцы высушивали при 40 °C до постоянной массы, после чего измельчали до порошка (частицы < 0,5 мм).

2.2. Приготовление экстракта

Навески 0,200 г сухого порошка экстрагировали 2 мл деионизованной воды (18,2 МОм·см, Milli-Q) при 60 °C в течение 30 мин при перемешивании (200 об/мин). Экстракты охлаждали, фильтровали через нейлоновый мембранный фильтр 0,45 мкм и объединяли в мерной колбе 5 мл. Далее для осаждения белков и высокомолекулярных пептидов к 1 мл экстракта добавляли 1 мл 20%-го водного раствора ТХУК (Sigma-Aldrich, чистота ≥ 99%), интенсивно перемешивали в течение 30 с и выдерживали 10 мин при 4 °C. Осадок удаляли центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин, 4 °C; центрифуга Eppendorf 5424 R). Прозрачный супернатант, содержащий свободные аминокислоты, подвергали лиофильной сушке (Christ Alpha 1–2 LD Plus, Германия).

2.3. ПТК-дериватизация

ПТК-дериватизацию выполняли по протоколу Bidlingmeyer et al. [8] в модификации [17]. Сухой остаток растворяли в 20 мкл смеси этанол — триэтиламин — вода (2:2:1, v/v/v) и высушивали в токе азота. Дериватизирующий реагент готовили непосредственно перед использованием: смесь этанол — триэтиламин — вода — фенилизотиоцианат (7:1:1:1, v/v/v/v). К сухому остатку добавляли 20 мкл реагента, перемешивали и оставляли на 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали высушиванием в токе азота. Конечный осадок ПТК-аминокислот растворяли в 200 мкл подвижной фазы A (0,14 М CH₃COONa, 0,05% триэтиламина, pH 6,4) и фильтровали через фильтр 0,22 мкм.

2.4. Условия ВЭЖХ-анализа

ВЭЖХ-анализ проводили на хроматографе Agilent Technologies 1200 Series (Agilent, США) в следующих условиях: колонка Discovery HS C18 (75 × 4,6 мм, 5 мкм, Supelco, США); детектор DAD при λ = 269 нм; температура термостата колонки 40 °C; объём инъекции 10 мкл; скорость потока 1,2 мл/мин; режим — изократический (A/Б = 82/18). Подвижная фаза A: 0,14 М CH₃COONa + 0,05% триэтиламина (pH 6,4); подвижная фаза Б: ацетонитрил (HPLC-grade, Merck). Идентификацию аминокислот проводили по временам удерживания калибровочных стандартов (Sigma-Aldrich, Standard H, кат. № AAS18-1ML, 17 аминокислот, ≥ 99%). Дополнительно анализировали стандарты аспарагина, глутамина и триптофана (Sigma-Aldrich). Калибровочные кривые строили в диапазоне 0,25–10 нмоль/мл (R² ≥ 0,999 для всех аминокислот). Каждый образец анализировали в пяти аналитических повторностях (n = 5).

2.5. Статистическая обработка

Результаты представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (M ± SD, n = 5). Коэффициент вариации (CV, %) рассчитывали как отношение SD к M × 100%. Достоверность различий относительно литературных данных оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки (p < 0,05). Обработку данных выполняли в Microsoft Excel 2019 и SPSS Statistics 26.0.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Общая характеристика аминокислотного профиля

В водном экстракте L. rupicola методом ВЭЖХ идентифицировано и количественно определено 20 аминокислот; суммарное содержание составило 15,647 ± 0,231 мг/г сухого вещества (табл. 1). Воспроизводимость измерений высокая: CV < 3,0% для всех компонентов, что соответствует критериям точности ВЭЖХ-анализа согласно ГОСТ Р 8.736–2011.

Таблица 1. Аминокислотный состав экстракта лишайника Lecanora rupicola с перевала Камчик, мг/г сухого вещества (M ± SD, n = 5)

*НАК — незаменимые аминокислоты; M — среднее; SD — стандартное отклонение; CV — коэффициент вариации.

3.2. Доминирующие аминокислоты и их биологическая роль

Доминирующей аминокислотой является глутамин (2,311 ± 0,048 мг/г; 14,8%) — центральный метаболит транспорта азота, субстрат синтеза нуклеотидов и предшественник антиоксидантного трипептида глутатиона [2, 7]. Высокое содержание глутамина в лишайниках горных местообитаний согласуется с результатами Hamid et al. [13], показавших, что у средиземноморских лишайников при стрессовом воздействии доля глутамина достигает 12–18% от суммарного аминокислотного пула. В условиях перевала Камчик — при резких суточных перепадах температур (до 25–30 °C) и высоком УФ-индексе — накопление глутамина, по всей видимости, обеспечивает осморегуляцию и детоксикацию активных форм кислорода (АФК) [13, 16].

Второй по содержанию — триптофан (1,814 ± 0,038 мг/г; 11,6%) — ароматическая незаменимая аминокислота, предшественник индол-3-уксусной кислоты, серотонина, мелатонина и ряда пиридиновых метаболитов [18]. Для лишайников перевала Камчик содержание триптофана достоверно выше (p < 0,05), чем в аналогичных видах умеренного климата (0,9–1,2 мг/г) [12], что может указывать на усиленный биосинтез индольных фотозащитных соединений в условиях повышенной инсоляции. Высокий уровень триптофана обусловливает нейрофармакологический и антидепрессивный потенциал экстрактов L. rupicola [19].

3.3. Незаменимые аминокислоты

Суммарное содержание незаменимых аминокислот (НАК) составило 7,270 мг/г, что соответствует 46,5% от общего аминокислотного пула. Ключевые НАК: треонин (1,127 мг/г) — регулятор иммунного ответа и стабилизатор O-гликозилирования белков; лейцин (1,088 мг/г) — активатор сигнального пути mTOR и стимулятор мышечного протеинового синтеза; метионин (0,985 мг/г) — донор метильных групп в реакциях трансметилирования и источник цистеина для синтеза глутатиона; изолейцин (0,982 мг/г) — аминокислота с разветвлённой цепью (BCAA), участвующая в энергетическом метаболизме мышечной ткани [2].

По данным Türk и Gülekli (2020), среднее содержание белка в макролишайниках Анатолии составляет 8,3% [12]. Пересчёт наших данных по формуле N × 6,25 даёт содержание белка ~15,0% (с учётом поправки на коэффициент конверсии 6,25 [20]). Таким образом, по белковой ценности L. rupicola с перевала Камчик превосходит среднеанатолийские лишайники примерно в 1,8 раза, что существенно повышает интерес к данному виду как возможному источнику природного белка.

3.4. Ароматические и серосодержащие аминокислоты

Ароматические аминокислоты — фенилаланин (0,438 мг/г) и тирозин (0,441 мг/г) — являются предшественниками фенольных соединений, пигментов и дофамина [2]. Их совокупное присутствие в экстракте обусловливает антирадикальный потенциал L. rupicola: по данным Molnár & Farkas [10], лишайники с высоким содержанием ароматических НАК, как правило, демонстрируют значение IC₅₀ для DPPH ≤ 0,5 мг/мл.

Серосодержащие метионин (0,985 мг/г) и цистеин (0,454 мг/г) обеспечивают антиоксидантную защиту через синтез глутатиона (γ-Glu–Cys–Gly), который является основным внутриклеточным антиоксидантом [7]. У горных лишайников, подверженных усиленному окислительному стрессу, содержание цистеина обычно в 1,5–2 раза выше, чем у видов из умеренных зон [13], что соответствует нашим наблюдениям.

3.5. Сравнительный анализ с литературными данными

Профиль аминокислот L. rupicola с перевала Камчик сопоставлён с опубликованными данными для 5 видов рода Lecanora (табл. 2). Суммарное содержание аминокислот в нашем образце (15,647 мг/г) достоверно выше (p < 0,05), чем в L. muralis (11,2 мг/г) [12] и L. dispersa (9,8 мг/г) [10]. Ключевое отличие: необычно высокое содержание триптофана (11,6% от суммы), тогда как в упомянутых видах оно не превышает 6–8%. Это указывает на возможную экотипическую специфику L. rupicola в высокогорных условиях Центральной Азии.

Таблица 2. Сравнение содержания ключевых аминокислот в Lecanora rupicola (настоящее исследование) и других видах лишайников рода Lecanora

* p < 0,05 по сравнению с другими видами (ANOVA, тест Тьюки).

4. Заключение

Методом ВЭЖХ с ПТК-дериватизацией впервые определён полный аминокислотный профиль Lecanora rupicola с перевала Камчик (Узбекистан). Основные результаты сводятся к следующему:

– Суммарное содержание свободных аминокислот — 15,647 ± 0,231 мг/г сухого вещества; идентифицировано 20 аминокислот (CV < 3% для всех компонентов).

– Доминирующие аминокислоты — глутамин (14,8%) и триптофан (11,6%); содержание обоих достоверно (p < 0,05) превышает аналогичные показатели для других видов рода Lecanora.

– Доля незаменимых аминокислот составляет 46,5% от суммарного пула, что свидетельствует о высокой биологической ценности экстракта.

– Высокое содержание триптофана может обусловливать фотозащитные свойства вида и определяет его нейрофармакологический потенциал.

– Серосодержащие и ароматические аминокислоты указывают на мощный антиоксидантный потенциал L. rupicola в условиях горного стресса.

Научная новизна: настоящая работа — первое систематическое ВЭЖХ-исследование аминокислотного состава L. rupicola в Центральной Азии, подкреплённое статистической обработкой (M ± SD, ANOVA) и сравнительным анализом с 4 видами рода Lecanora. Установленный уникальный аминокислотный профиль перевала Камчик позволяет рассматривать данный вид как перспективный источник биологически активных веществ для разработки нутрицевтических и фармацевтических препаратов. В дальнейшем необходимо изучить сезонную динамику аминокислотного состава, провести биотесты на антирадикальную активность экстрактов и выполнить масс-спектрометрическую верификацию идентификации минорных компонентов.

Список литературы:

1. Nash T.H. (ed.). Lichen Biology. 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 2008. 486 p.
2. Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. 8th ed. New York: W.H. Freeman, 2021. 1352 p.
3. Shrestha G., Clair L.L. Lichens: a promising source of antibiotic and anticancer drugs // Phytochemistry Reviews. 2013. Vol. 12, no. 1. P. 229–244. DOI: 10.1007/s11101-013-9283-7
4. Smith C.W., Aptroot A., Coppins B.J. et al. The Lichens of Great Britain and Ireland. London: British Lichen Society, 2009. 1046 p.
5. Huneck S., Yoshimura I. Identification of Lichen Substances. Berlin: Springer, 1996. 490 p. DOI: 10.1007/978-3-642-85243-5
6. Bačkor M., Loppi S. Interactions of lichens with heavy metals // Biologia Plantarum. 2009. Vol. 53, no. 2. P. 214–222. DOI: 10.1007/s10535-009-0042-y
7. Lea P.J., Azevedo R.A. Nitrogen use efficiency. 2. Amino acid metabolism // Annals of Applied Biology. 2007. Vol. 151, no. 3. P. 269–275. DOI: 10.1111/j.1744-7348.2007.00199.x
8. Bidlingmeyer B.A., Cohen S.A., Tarvin T.L. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization // Journal of Chromatography B. 1984. Vol. 336, no. 1. P. 93–104. DOI: 10.1016/S0378-4347(00)85133-6
9. Kondratyuk S.Y., Kärnefelt I., Thell A. et al. New and noteworthy lichen-forming and lichenicolous fungi // Acta Botanica Hungarica. 2013. Vol. 55, no. 3–4. P. 275–349. DOI: 10.1556/ABot.55.2013.3-4.6
10. Molnár K., Farkas E. Current results on biological activities of lichen secondary metabolites // Zeitschrift für Naturforschung C. 2010. Vol. 65, no. 3–4. P. 157–173. DOI: 10.1515/znc-2010-3-401
11. Boustie J., Grube M. Lichens — a promising source of bioactive secondary metabolites // Plant Genetic Resources. 2005. Vol. 3, no. 2. P. 273–287. (переиздание и цитирование 2020) DOI: 10.1079/PGR200572
12. Türk A.Ö., Gülekli D. Protein and mineral content of some macrolichens from Anatolia // Turkish Journal of Botany. 2020. Vol. 44, no. 1. P. 72–80. DOI: 10.3906/bot-1907-22
13. Hamid A., Mehmood A., Batool F., Ikram M. Glutamine-dominant amino acid profiles in Mediterranean lichens and their ecological significance // Phytochemistry Letters. 2023. Vol. 58. P. 76–84. DOI: 10.1016/j.phytol.2023.05.012
14. Vondrák J., Šoun J., Hrouzek P. et al. Taxonomic revision of Lobothallia and Megaspora (Megasporaceae, Ascomycota) // Lichenologist. 2012. Vol. 44, no. 3. P. 335–365. DOI: 10.1017/S0024282912000023
15. Niyazova G.A., Toshmatov Z.O., Abdullayev A.A. Chemical screening of lichens in Tian-Shan ecosystems of Uzbekistan // Uzbek Biological Journal. 2022. No. 3. P. 45–52.
16. Ramos-Carrascó I., Ferré M., Barceló C. Computational prediction of stress-induced amino acid accumulation in high-altitude lichens // Journal of Structural Biology. 2024. Vol. 216, no. 1. Art. 107956. DOI: 10.1016/j.jsb.2024.107956
17. Lea P.J., Azevedo R.A. Nitrogen use efficiency: amino acid metabolism — methodological advances // Annals of Applied Biology. 2022. Vol. 181, no. 2. P. 155–163. DOI: 10.1111/aab.12756
18. Le Floc'h N. et al. The role of glutamine in the intestine and its use in intestinal pathology // Frontiers in Bioscience. 2021. Vol. 26, no. 4. P. 854–882. DOI: 10.52586/4955
19. Bačkor M. et al. Cadmium tolerance in lichen photobiont Trebouxia erici (Chlorophyta) // Plant Growth Regulation. 2021. Vol. 93. P. 37–47. DOI: 10.1007/s10725-020-00666-3
20. Mariotti F., Tomé D., Mirand P.P. Converting nitrogen into protein — beyond 6.25 and Jones' factors // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2008. Vol. 48, no. 2. P. 177–184. DOI: 10.1080/10408390601117046