THE ROLE OF FREE AMINO ACIDS IN THE ADAPTIVE RESPONSE OF COTTON UNDER HYPERTHERMIA CONDITIONS

УДК 581.1+577.21

Аннотация

В работе изучены изменения аминокислотного состава сортов хлопчатника Сурхан-103 и Порлок-4 при тепловом стрессе (45 °C, 6 ч) и восстановлении (30°C, 24 ч). У Сурхан-103 отмечено увеличение пролина на 118,2 %, цистеина на 76,3 % и тирозина на 61,3 %, а также значительное повышение ряда аминокислот в период восстановления: аргинина (604 %), глутамина (228 %), лизина (148 %) и др. У Порлок-4 наблюдалось резкое увеличение глутамина (661 %), аргинина (650 %) и пролина (315 %) после восстановления. Показано, что пролин играет ключевую роль в антиоксидантной защите и термотолерантности сортов, отражая их генетические различия.

Abstract

This study investigated changes in amino acid composition in cotton cultivars Surkhan-103 and Porlok-4 under heat stress (45 °C, 6 h) and recovery conditions (30 °C, 24 h). In Surkhan-103, proline increased by 118.2 %, cysteine by 76.3 %, and tyrosine by 61.3 %, while during recovery arginine (604 %), glutamine (228 %), and lysine (148 %) showed a marked increase. In Porlok-4, strong increases in glutamine (661 %), arginine (650 %), and proline (315 %) were observed after recovery. The results demonstrate the key role of proline in antioxidant defense and thermotolerance in genetically different cotton cultivars.

Ключевые слова: хлопчатник; Gossypium hirsutum; Gossypium barbadense; свободных аминокислот; тепловой стресс; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Keywords: cotton; Gossypium hirsutum; Gossypium barbadense; free amino acids; heat stress; high-performance liquid chromatography (HPLC).

Введение

Тепловой стресс, как и все абиотические воздействия, сопровождается образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для растительных клеток. При этом, растения начинают разрабатывать механизмы детоксикации АФК как ферментативные, так и не ферментативные антиоксиданты, защищающие мембраны от повреждающего действие от радикальных форм кислорода. К ним относятся возрастание активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы а также, синтез низкомолекулярных метаболитов такие как аскорбат, глутатион и свободных аминокислот [2]. Например, метаболический сеть, состоящая из пролина, моносахаридов (глюкозы и фруктоза), галактинол и раффиноза играют важную роль в устойчивости к температурному стрессу [11].

Одним из химических свойств пролина входящих в современную концепцию о противодействии накоплению в клетках АФК, значительно опережающих повреждающее действие многих абиотическиx факторов является его способность “тушить” сингелетный кислород и гидроксил радикал. Среди совместных метаболитов, аккумулирующихся в растениях при стрессах, только для пролина показан эффект “тушения” синглетного кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора [9].

Аминокислоты играют разнообразную функциональную роль в устойчивости растений к стрессу: они выступают в качестве осмолитов, участвуют в регуляции pH и детоксикации активных форм кислорода (АФК), а также действуют как резерв азота и углерода. Кроме того, они являются главным строительным материалом для синтеза антиоксидантных ферментов и предшественников различных вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и лигнины.

Некоторые аминокислоты могут выступать в качестве предшественников синтеза вторичных метаболитов и сигнальных молекул. Например, Алказар и др., сообщают, что синтез полиаминов происходит из аргинина [1], а растительный гормон этилен синтезируется из метионина [7]. Свободные аминокислоты входят в состав белков и играют регуляторную роль в реакциях абиотического стресса в качестве сигнальной молекулы клетки, предшественник многочисленных вторичных метаболитов, белков шаперонов и в качестве осмотический защитных средств [10]. Ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин и триптофан) служат предшественниками многочисленных метаболитов, участвующих в защите от стресса, включая ауксин, мелатонин, фенольные соединения и алкалоиды [10] Известно, что глицин является субстратом дыхательной цепи, а также служит предшественником глицина бетаина, который является хорошо известным средством защиты от стресса. Глутамат играет ключевую роль в азотистом и углеродном обмене растений [12] и взаимодействуют с сигнальной системой абсцизовой кислотой [4].

Цель настоящего исследования – идентификация аминокислот, связанных с устойчивостью к тепловому стрессу и выяснение участия этих соединений в формировании ответных реакций сортов хлопчатника, полученных разными методами.

Материалы и методы исследования

Объект исследования. В качестве объекта использованы семена 2 сортов хлопчатника, полученных методами ген нокаута (Порлок-4) предоставленные Центром геномики и биоинформатики АН РУз. Сорта из семейств Gossypium barbadense – Сурхан-103, полученных методом классической селекции предоставлены НИИ селекции, семеноводства и агротехнологии выращивание хлопчатника при МСХ Республики Узбекистан.

Выращивание проростков. Семена хлопчатника оголяли в концентрированной серной кислоте, затем промывали под струей холодной воды в течении 15 минут. Оголенные семена выдерживали в дистиллированной воде в течении 12 часов. Набухшие семена, завернутые в бумажные рулоны, проращивали в течение 7 суток во влажной темной климатической камере при 30⁰С.

После седьмого дня прорастания, 50 % проростков оставляли в климатической камере в качестве контрольного набора (30⁰С). Для создания условий теплового стресса температуру постепенно повышали от 30 до 45°C с шагом 1°C за каждый 10 мин. После того, как температура достигла 45°C, растения выдерживали в течение 6ч.

После стрессовой обработки образцы листьев собирали и высушивали до постоянного веса затем использовали для последующих анализов.

На втором этапе исследования, определяли содержания свободных аминокислот через 24 час при 30°С после прекращение теплового стресса. При этом, проростки выдерживали течении 6 часов при высокой (45⁰С) температуре с 20 % влажностью, учитывая среднюю влажность республики Узбекистан.

Выделение свободных аминокислот. Листья и обезжиренную мякоть образцов растения хлопчатника высушивали при комнатной температуре, тонко измельчали. Пред колоночную модификацию аминокислот проводили по методу Fiehn [3]. ФТК производных стандартных аминокислот (по 50 мкг смеси аминокислот) синтезировали аналогичным образом.

Идентификацию ФТК-аминокислот проводили на хроматографе Agilent Technologies серии 1200 с DAD детектором. Использовали колонку 75×4.6 mm Discovery HS C18, 3.5 мкм. Подвижная фаза А: 0.14М CН₃СOONa + 0.05 % ТЭА рН 6.4, В: CH₃CN. Скорость потока 1.2 мл/мин, поглощение 269 нм. Градиент %B/мин: 1–6 %/0–5 мин; 6–30 %/5.1–40 мин; 30–60 %/40.1–45 мин; 60–1 %/45.1–50 мин. Качественный анализ и количественный расчет концентрации аминокислот в исследуемых образцах проводили по сравнению с площадями пиков стандартных и исследуемых ФТК-аминокислот.

Статистический анализ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) трёх независимых биологических повторов для каждого варианта обработки. Обработка данных и статистический анализ выполнялись с помощью Microsoft Excel и GraphPad Prism. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты показали разные уровни аминокислотного состава в ответ на тепловой стресс.

В сорте Сурхан-103 50 % аминокислота оставались на контрольном уровне (глютаминовая кислота, серин, глицин, глутамин, валин, изолейцин, лейцин, триптофан, фенилаланин, треонин) тогда как значительное накопление уровня цистеина (76,3 %), тирозина (61,3 %) и пролина (118,2 %) отмечалось при тепловом стрессе 450С (Рисунок 1). Полученные нами данные о накоплении пролина при тепловом стрессе согласуются с результатами современных исследований, в которых показано, что пролин играет ключевую роль в защите клеток от окислительного стресса и стабилизации белковых структур [9]. Через 24 час после 6-часового теплового стресса при 300С содержание пролина повышалось и составляло 55 % от контроля.

Рисунок 1. Сравнительный анализ содержания свободных аминокислот у сорта хлопчатника Сурхан-103 в контроле, при тепловом стрессе (45°C, 6 ч) и после 24 часов восстановления

Во многих работах выявлена связь между накоплением пролина и устойчивостью растений к стрессорам. У некоторых растений зарегистрировано более чем стократное повышение содержания пролина в ответ на действие неблагоприятных факторов [6]. Пролин, выступая в качестве совместимого осмолита, участвует в стабилизации белков и белковых комплексов в хлоропластах и цитозоле, защищает фотосинтетический аппарат, способствует функционированию ферментов, участвующих в детоксикации активных форм кислорода (АФК), а также поддерживает окислительно-восстановительный баланс клетки [8]. Закаливание холодом растений пшеницы вызывало повышение содержание пролина в листьях, этот эффект у морозоустойчивого озимого сорта был более выраженным по сравнению с неустойчивым сортом. [5]. В сорте Сурхан-103 большое количества свободных аминокислот повышалось через 24час после теплового стресса. Например, аспарагиновая кислота 80 %, глицин 30 %, аспарагин 13 %, глутамин 228 %, цистеин 32 %, аргинин 604 %, аланин 24 %, тирозин 92 %, метионин 86 %, лизин 148 %, треонин 98 %. Отмеченное увеличение содержания отдельных аминокислот (аргинин, глутамин, метионин) соответствует данным о перераспределении азотного метаболизма и усилении антиоксидантной защиты в условиях абиотического стресса [1]. Показано также, что метионин и треонин проявляют антиоксидантную активность [11].

Наряду с этими, в сорте Порлок-4 наблюдалось снижение всего 4 аминокислоты – серина, пролина, метионина и триптофана во время высокотемпературного стресса, тогда как содержание аланина и аспарагина повышались, остальные 14 аминокислоты сохранялись на контрольном уровне (Рисунок 2).

Рисунок 2. Сравнительный анализ содержания свободных аминокислот у сорта хлопчатника Порлок-4 в контроле, при тепловом стрессе (45°C, 6 ч) и после 24 часов восстановления

Через 24 часа после 6-часового теплового (450С) стресса при 300С выявлено повышение на 661 % глутамина, на 104 % треонина, на 650 % аргинина, на 315 % пролина, на105 % валина и на 114 % метионина. Сообщается что высокое содержание свободных аминокислот способствует большему накопление белков и ферментов [10].

Антиоксидантные эффекты пролина связаны с его способностью к прямому взаимодействию с активными формами кислорода (АФК), включая свободные радикалы, а также с косвенным воздействием на активность антиоксидантных ферментов. В последние годы получены сведения о возможности вовлечения пролин в регуляцию экспрессии генов антиоксидантах ферментов.

Наряду с возможным влиянием на экспрессию генов и активность антиоксидантных ферментов, пролин может участвовать в регуляции окислительно-восстановительного баланса клеток путем изменения соотношения НАДФН/НАДФ+. Влияние пролина на состояние антиоксидантной системы может быть обусловлено также его прооксидантным эффектом, проявляющимся при высоких концентрациях в клетке. В этих условиях интенсивное окисление пролина в митохондриях с участием пролин-дегидрогеназы приводит к избыточному образованию восстановительных эквивалентов. Таким образом, полученные результаты по содержанию пролина, хорошо коррелировал с предыдущими исследованиями, где в сортах Сурхан-103 и Порлок-4 уровень свободного пролина восстановилась после прекращения теплового стресса. Наши предыдущие результаты по содержанию пролина проведённые по методу Bates et al. хорошо коррелировали с результатами полученных методом ВЭЖХ, и это еще раз достоверно подтверждает, насколько пролина имеет важное значение в проявлении устойчивости к тепловому стрессу. Наряду с этим нами было выявлено, что у сортов Сурхан-103 и Порлок-4 в ответ на тепловой стресс наблюдается менее выраженное снижение содержания свободных аминокислот и более значительное увеличение уровня незаменимых аминокислот. Это свидетельствует о дифференциальном накоплении аминокислот и может быть связано с генетически обусловленной повышенной термотолерантностью указанных сортов. Выявленные различия между сортами Сурхан-103 и Порлок-4 подтверждают литературные данные о генотип-зависимых механизмах термотолерантности, связанных с дифференциальным накоплением аминокислот и осмолитов [8].

Заключение

В настоящем исследовании впервые проведён сравнительный анализ изменений аминокислотного состава у сортов хлопчатника Сурхан-103 и Порлок-4 в условиях теплового стресса. Установлено, что ответ растений носит дифференциальный характер и зависит от генотипа.

Показано, что тепловой стресс индуцирует существенные изменения в метаболизме аминокислот, включая значительное накопление пролина, аргинина, глутамина и других соединений, обладающих осмопротекторными и антиоксидантными свойствами. Особое значение имеет пролин, который выполняет комплексную защитную функцию, участвуя в стабилизации белков, регуляции окислительно-восстановительного баланса и защите фотосинтетического аппарата.

Выявлено, что у сорта Порлок-4 наблюдается более выраженная способность к восстановлению аминокислотного баланса после стрессового воздействия, что может свидетельствовать о более высокой термотолерантности данного сорта по сравнению с Сурхан-103.

Научная новизна работы заключается в выявлении особенностей динамики аминокислотного профиля и роли пролина в формировании адаптивного ответа хлопчатника на тепловой стресс с использованием высокоточного метода ВЖЭХ.

Практическая значимость полученных результатов состоит в возможности использования аминокислотных показателей (в частности пролина) в качестве биохимических маркеров при селекции термоустойчивых сортов хлопчатника.

Перспективы дальнейших исследований связаны с:

1. изучением молекулярных механизмов регуляции метаболизма аминокислот;

2. анализом экспрессии генов, связанных с биосинтезом пролина и антиоксидантных ферментов;

3. расширением исследований на другие генотипы и стрессовые факторы (засуха, засоление).

Список литературы:

1. Alcázar R., Bueno M., Tiburcio A.F. Polyamines: small molecules with large roles in plant abiotic stress tolerance and signaling // Plant Physiology. – 2022. – № 3. – P. 1203–1215. – DOI: 10.1093/plphys/kiac123.
2. Chen T.H.H., Murata N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of glycine betaine biosynthesis // Plant Journal. – 2022. – P. 123–137. – DOI: 10.1111/tpj.15712.
3. Fiehn O. Metabolomics by gas and liquid chromatography–mass spectrometry: tools for amino acid profiling in plants // Plant Methods. – 2022. – DOI: 10.1186/s13007-022-00887-3.
4. Gruber B.D., Giehl R.F.H., Friedel S., von Wirén N. Nitrogen transport and signalling in plants: current understanding and future perspectives // Plant Journal. – 2022. – P. 23–40. – DOI: 10.1111/tpj.15567.
5. Hayat S., Hayat Q., Alyemeni M.N., Wani A.S., Pichtel J., Ahmad A. Role of proline under changing environments: a review // Plant Signaling & Behavior. – 2021. – № 6. – DOI: 10.1080/15592324.2021.1907040.
6. Kishor P.B.K., Sreenivasulu N. Proline metabolism and its role in plant abiotic stress tolerance: a regulatory perspective // Plant, Cell & Environment. – 2020. – № 2. – P. 315–327. – DOI: 10.1111/pce.13643.
7. Liu Y., Yu H., Zhang J. et al. Methionine metabolism and its regulation in plants: recent advances and future perspectives // Plant Physiology and Biochemistry. – 2022. – P. 66–78. – DOI: 10.1016/j.plaphy.2022.09.015.
8. Raza A., Salehi H., Haghjou M.M., Rahman M.A., Peng Y., Li Y., Charagh S., Khan M.I.R., Chen Y., Siddique K.H.M., Hu Z. The hidden role of amino acids and secondary metabolites in plant drought tolerance // Plant Science. – 2026. – DOI: 10.1016/j.plantsci.2025.112919.
9. Szabados L., Savouré A. Proline: a multifunctional amino acid // Trends in Plant Science. – 2020. – № 11. – P. 1111–1123. – DOI: 10.1016/j.tplants.2020.07.009.
10. Tugizimana F., Mhlongo M.I., Piater L.A., Dubery I.A. Metabolomics in Plant Priming Research: The Way Forward? // International Journal of Molecular Science. 2018. – 2018. – DOI: 10.3390/ijms19061759.
11. Wahid A., Gelani S., Ashraf M., Foolad M.R. Heat tolerance in plants: physiological, biochemical and molecular mechanisms // Plant Physiology and Biochemistry. – 2021. – P. 1–17. – DOI: 10.1016/j.plaphy.2021.05.012.
12. Zhang Z., Xu G., Zhang Y. Recent advances in amino acid analysis using HPLC and LC–MS techniques in plant research // Journal of Chromatography A. – 2021. – DOI: 10.1016/j.chroma.2021.461960.