DETERMINATION OF THE AMINO ACID COMPOSITION OF THE PLANT Plantago major BY HPLC

УДК 542.06+543.432

АННОТАЦИЯ

Данное исследование посвящено определению качественного и количественного состава аминокислот в семенах Plantago major. Анализы проводились методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В результате исследования было идентифицировано 18 аминокислот, суммарное содержание которых составило 283,857 мг/г. Наибольшие концентрации были характерны для лейцина, аспарагина и изолейцина. Также в значительных количествах были выявлены аспартат, валин и треонин, что свидетельствует о высокой насыщенности исследуемого растительного сырья биологически важными соединениями.

Установлено, что наличие незаменимых аминокислот повышает биологическую и фармацевтическую ценность растения. Высокое содержание незаменимых аминокислот в составе растения указывает на целесообразность дальнейшего изучения потенциальной биологической активности его экстрактов в биохимических и фармакологических исследованиях. Кроме того, исследование показало, что метод высокоэффективной жидкостной хроматографии обладает высокой точностью, чувствительностью и надёжностью при анализе аминокислотного состава растительного сырья и может эффективно применяться для его стандартизации, идентификации и контроля качества.

Полученные данные расширяют существующие сведения о химическом составе Plantago major и могут служить научной основой для дальнейших фармакологических, фитохимических и биохимических исследований данного лекарственного растения.

ABSTRACT

This study is devoted to the qualitative and quantitative determination of the amino acid composition in the seeds of Plantago major. The analyses were carried out using high-performance liquid chromatography (HPLC). As a result of the study, 18 amino acids were identified, with a total content of 283.857 mg/g. The highest concentrations were observed for leucine, asparagine, and isoleucine. Significant amounts of aspartate, valine, and threonine were also detected, indicating a high abundance of biologically important compounds in the investigated plant material.

It was established that the presence of essential amino acids enhances the biological and pharmaceutical value of the plant. The high content of essential amino acids in the plant indicates the relevance of further investigation of the potential biological activity of its extracts in biochemical and pharmacological studies. In addition, the study demonstrated that the high-performance liquid chromatography method possesses high accuracy, sensitivity, and reliability in the analysis of the amino acid composition of plant raw materials and can be effectively applied for their standardization, identification, and quality control.

The obtained data expand the existing knowledge on the chemical composition of Plantago major and may serve as a scientific basis for further pharmacological, phytochemical, and biochemical studies of this medicinal plant.

Ключевые слова: Plantago major; аминокислоты; ВЭЖХ; хроматография; экстракция; хроматограмма; стандартизация..

Keywords: Plantago major; amino acids; high-performance liquid chromatography (HPLC); chromatography; extraction; chromatogram; standardization.

Введение

Лекарственные растения являются природным источником биологически активных веществ и играют важную роль в фармацевтической и медицинской практике. В последние годы активно проводятся научные исследования, направленные на углублённый химический анализ растительного сырья, идентификацию его активных компонентов и их стандартизацию. В частности, аминокислоты, содержащиеся в растениях, играют ключевую роль в синтезе белков, метаболических процессах и функционировании иммунной системы. В связи с этим определение аминокислотного состава лекарственных растений является важным критерием оценки их фармакологической ценности.

Plantago major (подорожник большой) широко используется в народной медицине и, по данным литературных источников, обладает противовоспалительными, ранозаживляющими, антимикробными и иммуномодулирующими свойствами. Однако для научного обоснования его фармацевтической ценности необходимо детальное изучение химического состава, в частности аминокислотного профиля, с применением современных аналитических методов.

Традиционные методы анализа могут характеризоваться значительной продолжительностью и ограниченной точностью. В связи с этим высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) рассматривается как один из наиболее надёжных и точных методов для качественного и количественного определения аминокислот и широко применяется в научной практике.

Несмотря на значимость Plantago major, достоверные хроматографические данные о качественном и количественном составе его аминокислот остаются ограниченными. В этой связи актуальным является исследование аминокислотного состава данного растительного сырья методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим анализом полученных данных и обоснованием биологической и фармацевтической значимости растения.

Обзор литературы и методы исследования

В последние годы активно проводятся научные исследования, направленные на углублённое изучение химического состава лекарственных растений рода Plantago, а также на идентификацию биологически активных соединений с применением современных аналитических методов. В частности, Turgumbayeva и соавт. исследовали фитохимический состав листьев Plantago major, произрастающего в Казахстане, и выявили наличие широкого спектра биологически активных веществ, обосновав его фармацевтическую ценность [1-4]. Аналогично, Suyungaliyeva провела фитохимический анализ образцов Plantago major, произрастающих в экосистемах Западного Казахстана, продемонстрировав зависимость состава соединений от региональных экологических факторов [5].

Для определения компонентного профиля видов рода Plantago широко применяются комплексные подходы, основанные на высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Так, Xu и соавт. провели высокоточный анализ полифенольного состава Plantago depressa, показав, что комбинация высокоскоростной противоточной хроматографии и HPLC–DAD–QTOF-MS/MS является эффективной для идентификации широкого спектра биологически активных соединений [6,7].

Имеются также исследования, посвящённые комплексной оценке состава семян Plantago. Wang и соавт., анализируя вторичные метаболиты, установили наличие в семенах различных классов биологически активных веществ [8]. Triastuti и соавт. при изучении противовоспалительной активности экстрактов и фракций Plantago major in vivo идентифицировали фитохимические компоненты с использованием высокоточной масс-спектрометрии [9,10]. В свою очередь, Mukemre и соавт. подтвердили антиоксидантную и иную биологическую активность представителей рода Plantago.

Анализ представленных литературных данных показывает, что растения рода Plantago характеризуются широким спектром биологически активных соединений, определяемых преимущественно хроматографическими и масс-спектрометрическими методами. Однако сведения об аминокислотном составе Plantago major остаются недостаточно систематизированными. В связи с этим определение качественных и количественных характеристик аминокислот в местном растительном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) представляет научный и практический интерес.

Растительное сырьё предварительно измельчали до размера частиц около 1 мм, после чего навеску массой 5,0 г (с точностью 0,001 г) помещали в колбу объёмом 100 мл, оснащённую обратным холодильником. К образцу добавляли 50 мл 6 N раствора HCl и проводили гидролиз при температуре 110 °C в течение 24 часов с использованием магнитной мешалки. После завершения гидролиза раствор охлаждали до комнатной температуры, отбирали 10 мл и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Из полученного супернатанта отбирали 5 мл и нейтрализовали раствором 6 N NaOH. Далее 1 мл раствора фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм, помещали во виалу и использовали для инструментального анализа.

Качественный и количественный анализ аминокислот в образцах проводили с использованием стандартных образцов (Sigma-Aldrich, Германия) на системе Agilent Technologies (США) — Agilent 1260 Infinity II с флуоресцентным детектором (FLD). Разделение осуществляли на колонке Eclipse AAA (150 × 4,6 мм, 3,5 мкм). Предколоночная дериватизация проводилась в автоматическом режиме с использованием реагентов: а) о-фталальдегид + 3-меркаптопропионовая кислота; б) 9-флуоренилметил хлорформиат (FMOC-Cl).

Подвижная фаза состояла из: фазы A — 40 мМ раствора дигидрофосфата натрия (pH 7,8) и фазы B — смеси ацетонитрил:метанол:вода (45:45:10).

Разделение осуществляли в градиентном режиме.

Таблица 1. Значения

Условия анализа. Условия проведения анализа были следующими: скорость потока подвижной фазы — 1,0 мл/мин, температура термостата колонки — 40°C, объём инъекции — 2 мкл, продолжительность анализа — 30 минут.

Полученные на приборе результаты выражались в единицах мг/л и пересчитывались в мг/г по следующей формуле:

M(аминокислоты)=

где:

M — содержание аминокислоты (мг/г);

C — результат ВЭЖХ-анализа (мг/л);

V — общий объём гидролизата (мл);

m — масса навески (г);

2 — коэффициент нейтрализации.

Поскольку концентрации аминокислот превышали предел детектирования прибора, исследуемые растворы предварительно разводили в 3 раза. В последующих расчётах полученные значения корректировались с учётом коэффициента разведения (×3).

Результаты и обсуждение

Основной целью данного исследования являлась оценка качественного и количественного состава аминокислот в семенах Plantago major. В результате анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в исследуемом образце было идентифицировано 18  аминокислот, при этом их количественное распределение характеризовалось выраженной вариабельностью.

Рисунок 1. Хроматограмма стандартной смеси аминокислот, полученная методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Ex = 340 нм; Em = 450 нм).

Ниже приведены хроматограмма стандартной смеси аминокислот, а также хроматографический профиль аминокислот, содержащихся в семенах Plantago major.

Рисунок 2. Хроматограмма аминокислот, содержащихся в семенах Plantago major, полученная методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Ex = 340 нм; Em = 450 нм).

Таблица 2. Аминокислотный состав семян Plantago major

Согласно полученным данным, наибольшее содержание было характерно для лейцин (39,272 мг/г), аспарагин (33,283 мг/г) и изолейцин (32,759 мг/г). Также относительно высокие значения были установлены для аспартат (25,462 мг/г), валин (23,510 мг/г) и треонин (23,066 мг/г). Полученные результаты свидетельствуют о достаточном содержании аминокислот, необходимых для процессов белкового обмена и различных физиологических функций организма.

Суммарное содержание аминокислот составило 283,857 мг/г, что подтверждает высокую обогащённость исследуемого сырья аминокислотами. Особенно важно присутствие незаменимых аминокислот — лейцин, изолейцин, валин, метионин и фенилаланин — что дополнительно повышает биологическую и фармацевтическую ценность Plantago major.

Обсуждение результатов показывает, что выявленные аминокислоты могут быть тесно связаны с биологической активностью растения. В частности, аминокислоты с разветвлённой цепью — лейцин, изолейцин и валин — участвуют в активации метаболических процессов, регенерации тканей и усилении иммунного ответа. Кроме того, пролин и аланин связаны с синтезом коллагена и процессами клеточной регенерации, что может частично объяснять ранозаживляющие и противовоспалительные свойства Plantago major.

В ходе исследования также были выявлены определённые методические ограничения. Так, нулевые значения для глутамин и серин могут быть связаны с программной обработкой отрицательных значений интерсепта калибровочной кривой. Кроме того, крайне низкое содержание триптофан может объясняться его частичной деградацией в условиях кислотного гидролиза или снижением чувствительности на этапе дериватизации.

В этой связи в дальнейших исследованиях целесообразно оптимизировать условия гидролиза (время и температуру), а также применять более мягкие методы анализа триптофана, в частности щелочной гидролиз.

Заключение

В данном исследовании качественный и количественный аминокислотный состав сырья Plantago major был определён и системно оценён методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные результаты подтвердили наличие в образце 18 аминокислот, при этом их количественное распределение характеризовалось выраженной дифференциацией.

Согласно результатам анализа, наиболее высокие концентрации были установлены для лейцин, изолейцин, аспарагин, аспартат, валин и треонин, что свидетельствует о богатом аминокислотном составе, важном для процессов белкового обмена и физиологической активности. Наличие незаменимых аминокислот, таких как лейцин, метионин и фенилаланин, подтверждает высокий биологический и фармацевтический потенциал исследуемого сырья.

Наличие высокого содержания незаменимых аминокислот в составе Plantago major свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения потенциальной биологической активности экстрактов данного растения в биохимических и фармакологических исследованиях.

Полученные хроматографические данные ещё раз подтверждают, что метод высокоэффективной жидкостной хроматографии является высокоточным и надёжным аналитическим инструментом для стандартизации растительного сырья, контроля качества и эффективного использования лекарственных растений.

В целом, выдвинутая в работе гипотеза о наличии биологически активных аминокислот в Plantago major и возможности их точного определения была полностью подтверждена. В дальнейшем перспективным является сравнительное изучение аминокислотного состава в различных фазах вегетации и агроэкологических условиях, а также анализ его взаимосвязи с другими биологически активными соединениями.

References:

1. Mahmutaliyev R.R., Xikmatullayev I.L. Plantago major o’simligi – tabiiy xomashyo manbai va dorivor o’simlik sifatidagi tahlili. Ilm-fan muammolari magistrlar talqinida. Respublika ilmiy-amaliy konferensiya. 2025-yil 20-noyabr, 113-115 b.
2. Mahmutaliyev R.R., Xikmatullayev I.L. Plantago major o’simligining kimyoviy tarkibi va biologik faolligi. “Kimyo ta’limini ilmiy tadqiqot, raqamli texnologiyalar va sanoat hamkorligi bilan uyg’unlashtirish” mavzusidagi xalqaro ilmiy-amaliy konferensiyasi materiallari. Jizzah, 22-23 may 2026-yil. 113-115 b.
3. Botirova M.B., Qirg’izov Sh.M. Katta zubturum (Plantago major) plantoglitsidining kimyoviy tarkibi va uning dorivorlik xususiyatlari (balg’am ko’chiruvchi, oshqozon va ichak yaralariga qarshi gemostatik vosita). “Farmatseftika, biotexnologiya va biotibbiyotda zamonaviy tadqiqotlar va ilmiy yangiliklar” mavzusidagi xalqaro ilmiy-amaliy konferensiya. Andijon 23-24 aprel 2025-yil. 590-592 b.
4. Turgumbayeva A., Zhakipbekov K., Shimirova Z., Akhelova S., Amirkhanova A., Koilybayeva M., & Abdambayev, D. Study of phytochemical compounds of Plantago major leaves grown in Kazakhstan. Pharmacia, 69, 2022. 1019–1026 p. https://doi.org/10.3897/pharmacia.69.e91527
5. Suyungaliyeva, D. Фитоҳимический анализ подорозҳника болъшого (Plantago major L), произрастаючего в экосистеме Западно-Казакстанской области. (Plantago major L.), Vestnik ZKU, 2023. 89(1), 19.
6. Xu J., Tong C., Fu Q., Guo, K., Shi S., & Xiao Y. Comprehensive polyphenolic profile of Plantago depressa using high-speed countercurrent chromatography off-line with high-performance liquid chromatography–diode array detector–quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. eFood, 2020. 1(1), 94–105 p. https://doi.org/10.2991/efood.k.200916.001
7. Gao H., Liu Z., Song F., Xing J., Zheng Z., & Liu S. A strategy for identification and structural characterization of compounds from Plantago asiatica L. by liquid chromatography-mass spectrometry combined with ion mobility spectrometry. Molecules, 2022. 27(13), 4302. https://doi.org/10.3390/molecules27134302
8. Wang D., Qi M., Yang Q., Tong R., Wang R., Bligh S., Yang, L., & Wang, Z. Comprehensive metabolite profiling of Plantaginis Semen using ultra high performance liquid chromatography with electrospray ionization quadrupole time‐of‐flight tandem mass spectrometry coupled with elevated energy technique. Journal of Separation Science, 2016, 39(10), 1842–1852. https://doi.org/10.1002/jssc.201600052
9. Triastuti A., Pradana D. A., Setiawan I. D., Fakhrudin N., Himmi S. K., Widyarini S., & Rohman A. In vivo anti-inflammatory activities of Plantago major extract and fractions and analysis of their phytochemical components using a high-resolution mass spectrometry. Research in Pharmaceutical Sciences, 2022, 17(6), 665–676. https://doi.org/10.4103/1735-5362.361051
10.  Noibjonova, X. M. Andijon hududida o’sadigan zubturum (Plantago major) o’simligining kimyoviy tarkibi. Journal of Chemistry of Goods and Traditional Medicine, 2025, 4(6), 56–70 p.