OBTAINING CHITIN BASED ON Acheta deserta Pall. AND DETERMINING THE POLYMORPHOUS FORM OF THE OBTAINED CHITIN

УДК 577.1.

Аннотация

Хитин — это очень важный биополимер, встречающийся у членистоногих и грибов. В настоящее время области изучения, выделения и применения хитина и его производных из новых источников постоянно расширяются. В данном исследовании хитин был выделен из Acheta deserta Pall. классическим методом, а также изучены структура и морфология полученного хитина.

В ходе исследования первоначально 20 г исходного сырья в сухом виде были измельчены на специальной установке до порошкообразного состояния, после чего образец промывали деионизированной водой для удаления посторонних примесей. Затем образец высушивали при температуре 50 °C. На следующем этапе проводили процесс деминерализации: образец обрабатывали 1 М раствором соляной кислоты (HCl) при нагревании на водяной бане. После этого минеральные вещества удаляли путем фильтрования с последующей промывкой до нейтральной среды. Далее осуществляли стадию депротеинизации, в ходе которой для удаления белков образец обрабатывали раствором гидроксида натрия (NaOH). На заключительном этапе проводили депигментацию: с целью удаления окрашивающих веществ сырье обрабатывали этанолом, после чего очищенный продукт высушивали.

Выделенный биополимер хитина был идентифицирован по полиморфной форме на основе анализа его ИК-спектра и сопоставления с литературными данными. Наличие нерасщеплённой полосы поглощения в области 1654 см⁻¹, характерной для амидной группы I, свидетельствует о том, что хитин, выделенный из Acheta deserta Pall., находится в кристаллическом состоянии и относится к полиморфной модификации β-хитина.

Кроме того, на рентгенофазовой дифрактограмме образца хитина, полученного из Acheta deserta Pall., наблюдаются два интенсивных пика при 9,8° и 19,9°, что также подтверждает его принадлежность к полиморфной форме β-хитина.

Abstract

Chitin is a very important biopolymer found in arthropods and fungi. Currently, the fields of identification, extraction, and application of chitin and its derivatives from new sources are continuously expanding. In this study, chitin was extracted from Acheta deserta Pall. using a classical method, and the structure and morphology of the obtained chitin were investigated.

During the study, an initial 20 g of dry raw material was ground into a fine powder using a specialized device, after which the sample was washed with deionized water to remove impurities. The sample was then dried at 50 °C. At the next stage, a demineralization process was carried out: the sample was treated with a 1 M hydrochloric acid (HCl) solution under heating in a water bath. Mineral components were subsequently removed by filtration followed by washing with deionized water until a neutral medium was achieved. This was followed by a deproteinization step, during which the sample was treated with a sodium hydroxide (NaOH) solution to remove proteins. In the final stage, depigmentation was performed: the material was treated with ethanol to eliminate coloring substances, after which the purified product was dried.

The isolated chitin biopolymer was identified in terms of its polymorphic form based on the analysis of its IR spectrum and comparison with literature data. The presence of an un-split absorption band at 1654 cm⁻¹, characteristic of the amide I group, indicates that the chitin isolated from Acheta deserta Pall. is in a crystalline state and belongs to the β-chitin polymorphic form.

Furthermore, the X-ray diffraction pattern of the chitin sample obtained from Acheta deserta Pall. shows two intense peaks at 9.8° and 19.9°, which also confirms its принадлежность to the β-chitin polymorphic form.

Ключевые слова: хитин, Acheta deserta Pall., деминерализация, депротеинизация, депигментация, ИК-спектр, рентгенодифракционный анализ (XRD).

Keywords: chitin, Acheta deserta Pall., demineralization, deproteinization, depigmentation, IR spectrum, XRD.

Введение

Основными источниками хитина являются ракообразные, такие как крабы и креветки, а также насекомые, водоросли и клеточные стенки некоторых грибов. Запасы хитина в биосфере составляют не менее 10 Гт (1 × 10¹³ кг). Хитин представляет собой гомополимер, состоящий из звеньев N-ацетил-D-глюкозамина, соединённых β-(1→4) связями, и занимает второе место по распространённости в природе после целлюлозы [1,2].

Содержание азота в хитине относительно высокое (6,89%), что определяет его важное значение. Благодаря биодеградируемости, биосовместимости и нетоксичности хитин широко применяется в пищевой промышленности и биомедицине в качестве плёнок, гидрогелей и полупроницаемых мембран. Кроме того, он используется в тканевой инженерии благодаря проявлению иммунологических и антибактериальных свойств, способности ускорять заживление ран и служить системой доставки лекарственных веществ [1,2,3].

В живых организмах хитин встречается в комплексе с фибриллярными белками, липидами, карбонатом кальция и пигментами [3,4].

В природе известно три кристаллические формы хитина: α-, β- и γ-хитин. α-хитин является наиболее стабильной и распространённой формой, в которой мономерные цепи расположены антипараллельно. Такая организация способствует образованию прочных межмолекулярных водородных связей. β-хитин имеет параллельную ориентацию цепей, что приводит к более слабым межмолекулярным взаимодействиям и, соответственно, меньшей стабильности по сравнению с α-хитином. γ-хитин встречается реже (например, в коконах некоторых насекомых) и представляет собой комбинацию параллельных и антипараллельных цепей α- и β-хитина [4,5,6,7].

Рисунок 1. Полиморфные конфигурации хитина

На рентгенодифракционных (XRD) дифрактограммах α-хитина, выделенного из различных источников (крабы, креветки, гаммарус, криль, пчёлы и другие насекомые), наблюдаются интенсивные пики при 9° и 19°, а также менее выраженные пики при 12°, 23° и 26°. Для β-хитина характерны уширенные и менее интенсивные пики при 9,1° и 20,3°. γ-хитин проявляет два интенсивных пика при 9,6° и 19,8°. При этом γ-хитин, обладая смешанной (параллельной и антипараллельной) структурой, по характеру своей дифрактограммы ближе к α-хитину, чем к β-хитину [6,8,9].

В ИК-спектрах хитина, полученного из различных источников, фиксируются характерные полосы поглощения функциональных групп: 3400–3300 см⁻¹ — широкая полоса валентных колебаний О–Н-групп, участвующих в межмолекулярных водородных связях; 2975–2860 см⁻¹ — валентные колебания Csp³–H; 1700–1630 см⁻¹ — валентные колебания C=O; 1650–1550 см⁻¹ — деформационные колебания N–H; 1075–1020 см⁻¹ — валентные колебания C–O–C гликозидных связей; 870–900 см⁻¹ — деформационные колебания C–H в пиранозном кольце [4,5,10].

В настоящем исследовании поставлена цель — выделение хитина из широко распространённого насекомого — сверчка (Acheta deserta Pall.) и изучение полученного вещества с использованием физико-химических методов анализа.

По своей химической структуре хитин близок к целлюлозе, однако отличается тем, что является аминополисахаридом. В положении C-2 гидроксильные группы заменены ацетамидными группами, что обусловливает его уникальные свойства [1,2,5].

Хитин обладает гидрофобными свойствами, что ограничивает его практическое применение. Межмолекулярные водородные связи между группами –OH и –NHCOCH₃ приводят к формированию высокоупорядоченной кристаллической структуры.

Рисунок 2. Кристаллическая структура хитина

Межмолекулярная водородная связь между гидроксильной группой C3–OH и атомом кислорода C5–O, расположенная вдоль β-(1→4)-гликозидных связей, фиксирует звенья хитина в низкоэнергетической «кресельной» конформации, что приводит к образованию прочной и линейной полимерной цепи [2,4].

Классический метод получения хитина основан на последовательной обработке сырья кислотами и щелочами. Сухое сырьё предварительно измельчают. Депротеинизация проводится обработкой щелочным раствором. Деминерализация осуществляется с использованием раствора соляной кислоты до полного удаления минеральных компонентов. Затем полученный образец подвергают обесцвечиванию с помощью раствора перекиси водорода.

В рамках данного исследования нами была поставлена цель определить альтернативные источники хитина по сравнению с традиционным промышленным сырьём, разработать методику выделения биополимера хитина из выбранного сырья, а также установить полиморфную форму полученного хитина.

Методы исследований

В ходе эксперимента для измельчения образцов использовалась мельница IKA WERKE M20. Структура хитина, выделенного из Acheta deserta Pall., была изучена методом ИК-спектроскопии с использованием спектрометра PerkinElmer Spectrum IR (диапазон 4000–650 см⁻¹).

Рентгеноструктурный анализ выделенного хитина проводили на дифрактометре XRD MiniFlex-600 (Rigaku, Япония). Использовалось CuKα₁–α₂ излучение (соотношение Kα₁/Kα₂ = 50%), длина волны λ = 0,15406 нм, при напряжении 40 кВ и силе тока 30 мА. Сканирование выполнялось в диапазоне 2θ = 0°–70° со скоростью 2°/мин и шагом 0,05°.

1. Измельчение

Сначала 20 г сухого образца Acheta deserta Pall. измельчали до порошкообразного состояния с помощью мельницы IKA WERKE M20. Затем образец промывали деионизированной водой для удаления примесей. Полученный материал сушили в печи при 50 °C в течение 6 часов.

2. Деминерализация

Высушенный образец обрабатывали 100 мл 1 М раствора HCl при 60–65 °C в течение 2 часов на водяной бане. После этого проводили фильтрование с использованием воронки Бюхнера, колбы Бунзена и вакуумного насоса через фильтровальную бумагу (размер пор 1 мкм). Процесс деминерализации завершали промыванием деионизированной дистиллированной водой до нейтральной среды, после чего образец сушили при комнатной температуре.

3. Депротеинизация

Полученный на предыдущем этапе сухой образец обрабатывали 4%-ным раствором NaOH (100 г) при 80 °C в течение 1,5 часов. Затем материал фильтровали и промывали водой до нейтрального pH.

4. Депигментация

Для удаления окрашивающих примесей сырьё обрабатывали этанолом в течение 45 минут при 40 °C. После этого образец фильтровали и сушили на открытом воздухе.

Масса хитина, высушенного до постоянного веса, составила 1,6692 г, а его выход относительно исходного сырья — 8,296 %.

Результаты и обсуждения

В составе Acheta deserta Pall. было установлено содержание хитина в количестве 6–9% в пересчёте на сухую массу. Проведённое исследование основано на классическом традиционном методе и включает следующие этапы:

Сначала образец, состоящий из определённого количества особей, подвергали обработке слабоконцентрированным раствором HCl для деминерализации. Затем для удаления белковых веществ использовали раствор NaOH, а для удаления красящих веществ — этанол. После каждого этапа образец промывали до нейтральной среды и сушили.

Ниже представлен ИК-спектр хитина, полученного из Acheta deserta Pall. в ходе наших исследований:

Рисунок 3. ИК-спектр хитина, полученного на основе Acheta deserta Pall.

В ИК-спектре выделенного хитина наблюдаются полосы поглощения, соответствующие функциональным группам, присутствующим в молекуле: при 3369 см⁻¹ — О–Н группы, участвующие в межмолекулярных водородных связях; при 2922 см⁻¹ — полосы поглощения, обусловленные асимметричными валентными колебаниями метиленовых групп; при 1654 см⁻¹ — валентные колебания группы C=O в составе NHCOCH₃ (амид I); при 1592 см⁻¹ — деформационные колебания связи N–H в NHCOCH₃ (амид II); при 1425 см⁻¹ — деформационные колебания группы –CH₂– в –CH₂OH; при 1371 см⁻¹ — симметричные деформационные колебания группы –CH₃ в NHCOCH₃; при 1032 см⁻¹ — симметричные и асимметричные валентные колебания гликозидной связи C–O–C; при 891 см⁻¹ — валентные колебания связей C–H в пиранозном кольце. Полученные данные хорошо согласуются с литературными данными ИК-спектров хитина, выделенного из других источников.

Наличие в спектре чётко выраженной полосы поглощения амидной группы (амид I) при 1654 см⁻¹ (рис. 3) свидетельствует о кристаллическом состоянии хитина, выделенного из Acheta deserta Pall., и его соответствии β-хитиновой полиморфной форме.

Кроме того, на дифрактограмме хитина, полученного из Acheta deserta Pall. (рис. 4), наблюдаются два интенсивных пика при 9,8° и 19,9°, характерные для β-хитина.

Рисунок 4. Рентгенофазовая дифрактограмма хитина, полученного на основе Acheta deserta Pall.

Наблюдение острых пиков на дифрактограмме свидетельствует о более высокой степени кристалличности вещества и наличии сильных водородных связей (как межмолекулярных, так и внутримолекулярных).

Заключение

В данном исследовании биополимер хитин был выделен из Acheta deserta Pall. классическим методом. При этом промытое и высушенное сырьё было очищено на стадиях деминерализации, депротеинизации и депигментации. Из 20 г образца был получен хитин с выходом 8,296%, что составило 1,6692 г.

Полиморфная форма выделенного хитина была подтверждена на основании анализа ИК-спектра и его сравнения с литературными данными. Наличие в спектре характерной для амидной группы (амид I) полосы поглощения при 1654 см⁻¹ указывает на кристаллическое состояние хитина и его соответствие β-хитиновой полиморфной форме.

Кроме того, на рентгенофазовой дифрактограмме хитина, полученного из Acheta deserta Pall., наблюдались два интенсивных пика при 9,8° и 19,9°, что также подтверждает его принадлежность к β-хитиновой полиморфной форме.

Список литературы:

1. В.П. Варлaмов, А.В. Ильина, Б.Ц. Шагдaровa, А.П. Луньков, И.С. Мысякина. Хитин/хитозан и его прoизводные: фундаментaльные и приклaдные аспекты. Успехи биологическoй xимии, т. 60, 2020, 317-368 с.
2. Я. В. Максимовна. Получение и исследование свойств хитозановых материалов, модифицированных сополимерами глицидилметакрилата и алкилметакрилатов. Волгоград – 2022.
3. И.И.Осовская, Дoпoлнительные главы технолoгии полимeрных материалов. Санкт-Петербург 2021.
4. Sh.Karimov, A.Xaitbayev. Xitozan ajratib olish usullarini optimallash. FarDU ilmiy xabarlar. 2022-yil 6-son. 472-475 bet.
5. Новиков В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана/ В.Ю. Новиков //Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы седьмой международной конференции /ВНИРО.– Спб.–2003.– С.38-43.
6. Современные достижения и перспективы в исследовании хитина и хитозана/ В.М.Быкова, Л.И. Кривошеина, Е.А.Ежов и др.//Труды ВНИРО Т.143. Прикладная биохимия и технология гидробиотнов.–М.: ВНИРО.–2004– С.33-41.
7. M.Kaya, T.Baran, I.Saman, M.Asan Ozusaglam, Y.Selim Cakmak and A. Ment. Physicochemical characterization of chitin and chitosan obtained from resting eggs of Ceriodaphnia Quadrangular (Branchiopoda: Cladocera: Daphniidae) // Journal of Crustacean Biology. 2014. Volume 34, Issue 2, – pp. 283-288.
8. Luis-Felipe Sánchez, Jimmy Cánepa, Suyeon Kim and Javier Nakamatsu. A Simple Approach to Produce Tailor-Made Chitosans with Specific Degrees of Acetylation and Molecular Weights. Polymers (Basel). 2021 Jan; 13(15): 2415.
9. E.Kenawy, M.Abu Saied, A. Saafan, S.Salem. Synthesis, characterization and applications of novel modified chitosan materials for water treatment. Egypt. J. Chem. Vol. 65, No. 10 pp. 561 - 575 (2022).
10. G.A.Ikhtiyarova, F.N.Kurbanova // Оbtaining an ecologically pure biopolymer carboxymethyl chitosan from apis mellifera. 10 nov, 2021.P.1531-1536.

References:

1. Varlamov V.P., Ilyina A.V., Shagdarova B.Ts., Lun’kov A.P., Mysyakina I.S. [Chitin/chitosan and its derivatives: fundamental and applied aspects]. Uspekhi biologicheskoi khimii. 2020;60:317–368. (In Russ.)
2. Maksimovna Ya.V. [Preparation and study of the properties of chitosan materials modified with copolymers of glycidyl methacrylate and alkyl methacrylates]. Volgograd; 2022. (In Russ.)
3. Osovskaya I.I. [Additional chapters of polymer materials technology]. Saint Petersburg; 2021. (In Russ.)
4. Karimov Sh., Xaitbayev A. [Optimization of chitosan isolation methods]. FarDU ilmiy xabarlari. 2022;(6):472–475.
5. Novikov V.Yu. [Chemical hydrolysis of chitin and chitosan]. In: Sovremennye perspektivy v issledovanii khitina i khitozana: materialy sed’moi mezhdunarodnoi konferentsii. Saint Petersburg: VNIRO; 2003. p. 38–43. (In Russ.)
6. Bykova V.M., Krivosheina L.I., Ezhov E.A. et al. [Modern achievements and prospects in the study of chitin and chitosan]. Trudy VNIRO. Prikladnaya biokhimiya i tekhnologiya gidrobiontov. 2004;143:33–41. (In Russ.)
7. Kaya M., Baran T., Saman I., Asan Ozusaglam M., Selim Cakmak Y., Ment A. Physicochemical characterization of chitin and chitosan obtained from resting eggs of Ceriodaphnia quadrangular (Branchiopoda: Cladocera: Daphniidae). Journal of Crustacean Biology. 2014;34(2):283–288.
8. Sánchez L.F., Cánepa J., Kim S., Nakamatsu J. A simple approach to produce tailor-made chitosans with specific degrees of acetylation and molecular weights. Polymers (Basel). 2021;13(15):2415.
9. Kenawy E., Abu Saied M., Saafan A., Salem S. Synthesis, characterization and applications of novel modified chitosan materials for water treatment. Egyptian Journal of Chemistry. 2022;65(10):561–575.
10. Ikhtiyarova G.A., Kurbanova F.N. Obtaining an ecologically pure biopolymer carboxymethyl chitosan from Apis mellifera. 2021 Nov 10:1531–1536.