Влияние источников азота на метаболические процессы у гриба Trichoderma harzianum

АННОТАЦИЯ

Подобран ряд сред для культивирования и оптимизированы условия для биосинтеза фермента, в дальнейшем можно использовать при разработке технологии осахаривания дешевых целлюлозосодержащих отходов и получения на основе этого сахаров.

ABSTRACT

The conditions of cellulose active producent cultivation of Trichoderma harzianum thermophylic fungi isolated from local soil and selected medium of micromicet strain was studied.The possibility of producent using for working out the technology of clucose obtaining and other released sugars under cellulose source saccharifying was indicated.

Ключевые слова: целлюлаза, целлюлоза, целлюлолитическая активность, биосинтез, гидролиз, гидролизат, фермент, клетчатка, сахар, гриб.

Keywords: cellulase, cellulose, cellulolytic activity, biosynthesis, hydrolysis, hydrolyzate, enzyme, fiber, sugar, fungi.

ВВЕДЕНИЕ

Отдельные вещества в составе субстрата имеют для микроорганизмов не только питательную ценность, но и создают благоприятную или неблагоприятную окружающую среду. Наибольшее влияние на рост микроорганизмов оказывают соли, сахара, кислоты, спирты, а также иногда и твердая фаза — свернувшийся белок. Условия роста и состав питательной среды существенно влияют на метаболические процессы у микроорганизмов и биосинтез или биологически активных соединений, в частности целлюлозы [1,2,3,6,7,8]. Источниками азота для различных продуцентов целлюлоз служили органические или минеральные формы. Мы изучали некоторые особенности биосинтеза целлюлозы у гриба Trichoderma harzianum его осахаривающую способность.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Гриб Trichoderma harzianum выращивали глубинном способом на качалках в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл с 50 мл питательной среды Mandels pH 5,5. Продолжительность культивирования 72-96 ч.  При температуре 30⁰С. Активность целлюлозы определяли по увеличению количества редуцирующих сахаров реакционной смеси после гидролиза субстрата (хлопковое волокно) по сравнению с контролем [4]. Осахаривающую способность учитывали по образованию редуцирующих сахаров под действием ферментов культуральной жидкости в гидролизатах растительных отходов методом Сомоджи-Нельсона [5].

РЕЗУЛЬТАТЫ И  ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты изучения динамики образования целлюлозы на двух средах-с чистой клетчаткой (фильтровальная бумага) и растительными отходами (верблюжьей колючки) показали, что фермент культуральной жидкости наиболее интенсивно накапливается в первые трое суток, затем процесс замедляется (Рис.1).

Рисунок 1. Динамика образования целлюлозы грибом Trichoderma harzianum

Причем, отмечено что закономерность биосинтеза на обоих средах сохранялось, варьирует лишь целлюлолитическая активность, повышаясь на среде с верблюжьей колючки (Рис.2). Установлено, что наиболее благоприятна для образования целлюлозы- слабокислая или нейтральная рН исходной питательной среды. Активность ферментов оставалась на одном уровне в диапазоне рН от 5,0 до 7,0. Снижение рН до 4,5 влияло отрицательно на рост и активность продуцента, а при рН 4,0 и ниже рост отсутствовал. Необходимо отметить, что по-видимому зависело от наличия на этой среде более активного комплекса целлюлоз с разным рН-оптимумом действия, а в среде с фильтровальной бумагой максимальная активность приходилась на рН 5,5. Культура гриба оказалось чувствительной к температуре культивирования. Если при 25-27⁰С наблюдалась низкая активность и слабый рост, то при повышении температуры до 30-32⁰С активность возрастала в 2-3 раза, отмечался обильный рост гриба в виде густой суспензии.

Рисунок 2. Динамика осахаривания целлюлозосодержащего сырья целлюлазой Trichoderma harzianum

С целью модификации среды Mandels применительно к продуценту оптимизировали ее состав методом исключения одного из компонентов, причем отдельно для каждого вида целлюлозосодержащего субстрата как единственного источника углерода, так как питательная ценность их может варьировать. Наиболее значимый компонент питательной среды и источник углерода-клетчатка в виде отходов растениеводства, при отсутствии которой в среде целлюлозная активность равна нулю. Необходимо отметить при замене целлюлозосодержащего источника в среде легкоусвояемым источником, как глюкоза, способствовала репрессии биосинтеза, видимо, свидетельствует об индуцибельном характере биосинтеза целлюлозы Trichoderma harzianum.  Далее при исключении из среды источника азота в виде (NH₂)₂HPO₄ целлюлозная активность снижалась 2-3 раза по сравнению с полноценной средой. Другие минеральные компоненты действовали по разному в зависимости от вида клетчатки. Наиболее высокая целлюлозная активность отмечена на подобранной нами среде с верблюжьей колючки или пшеничной соломой. В зависимости от вида целлюлозосодержащего сырья и потребностей производства могут быть использованы дешевые питательные среды упрощенного состава. Далее изучали осахаривающую способность целлюлозы  Trichoderma  harzianum по отношению к различному виду целлюлозных отходов. Предварительно деградировали субстраты на ножевой мельнице до размера частиц 0,2-0,5 мм. Затем сухие измельченные отходы обрабатывали активной культуральной жидкостью (рН 5,5) (модуль 1:15). При перемешивании на качалке 180-200 об/мин. в течении 6 ч. при 30⁰С, отмечено определяя содержание сахаров в гидролизатах. В результате исследований установили, что наибольшее количество сахаров отмечалось при ферментативном гидролизе верблюжьей колючки и кукурузных кочерыжек, по-видимому, за счет доступности их для действия целлюлоз и ксиланазы  Trichoderma harzianum. При этом степень конверсии составляет 30-50%. Труднее структурной модификации поддаются рисовая лузга (на 10%) из-за прочности ассоциации этих кристаллических полимеров с гемицеллюлозой или лигнином. Интенсивный гидролиз целлюлозосодержащих субстратов наблюдался в первые часы опыта, затем целлюлолитическое действие культуральной жидкости замедлялось в результате расходования фермента и ингибирующего влияния на активность образующихся редуцирующих сахаров.

Таким образом подобран ряд сред для культивирования и оптимизированы условия для биосинтеза фермента, в дальнейшем можно использовать при разработке технологии осахаривания дешевых целлюлозосодержащих отходов и получения на основе этого сахаров

Список литературы:

1. Клесов А.А. Ферментативные получение глюкозы и этанола из целлюлозы // Итоги науки и техники. БиотехнологияТ.18.1982.с.106-169.
2. Лобанок А.Г. Бабицкая В.Г. и др. Микробный синтез на основе целлюлазы // Белок и другие ценные продукты. Минск: Наука и техника 1988.261 с.
3. Нетрусов, А.И. Микробиология. Учебник/ А.И. Нетрусов, И.Б.Котова. – М.:Академия, 2012.
4. Основы биотехнологий: Учеб. Пособие для высш. пед. учеб. Заведений / Т. А. Егорова, С. М. Клунева, Е. А. Живухина. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 208 с.
5. Синицын А.П. и др. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов //Итоги науки и техники, сер.биотехнол. 1990.Т.25.с.3-147.
6. Федорова Э. И. Биотехнология: Учеб.пособие. – 2 – е изд. – Сыктывкар: СЛИ, 2000. – 156 с.
7. Watson T.G., Nelligan S. Pilor scale production of cellulose by Trichodermareisee (RUTC-30) Biotechnol Left. 1983 Vol.5.№1.p.25-28.
8. Somogyi M. Determenation of reducing sugar // S.Biol.Chem. 1952.Vol.195.p.19-28.