Получение и регенерация протопластов у грибов – продуцентов целлюлаз

АННОТАЦИЯ

В статье приведены методы получения протопластов у ряда микроскопических грибов рода Trichoderma. Установлено, что оптимальными стабилизаторами при образовании протопластов у испытанных культур являются сорбит и маннит. Наиболее активной лизирующий системой, позволяющей получать стабильные протопласты является система, состоящая из ПСУ, целлолигнорина и целлоафганина.

ABSTRACT

The article presents methods for obtaining protoplasts in a number of microscopic fungi of the genus Trichoderma. It was established that sorbitol and mannitol are the optimal stabilizers in the formation of protoplasts in the tested cultures. The most active lysing system that allows obtaining stable protoplasts is a system consisting of PSU, cellolignorin and celloafganin.

Ключевые слова: гриб, протопласт, микроскопический, стабилизатор, культура, лизирующий, система, активный.

Keywords: fungus, protoplast, microscopic, stabilizer, culture, lysing, system, active.

Введение: Весьма актуальное значение приобретает проблема изучения ферментов, катализирующих разщепление целлюлози до конечного продукта гидролиза–глюкозы и практическое использование этих ферментов в народном хозяйстве.

Целлюлоза представляет собой наиболее распространенное в природе органическое соединение. Она является главной составной частью оболочки клеток высших и низших растений. В большом количестве целлюлоза собирается с урожаем различных растений в виде хлопка, лына, конопли и других лубяных культур, соломы, оболочек семян, плодов и т. д.

В то время, как синтез целлюлозы осуществляется почти исключительно зелеными растениями, распад её в процессе круговорота вещества в природе совершается в основном различными микроорганизмами. Как теперь известно, даже жвачные животные, употребляющие значительное количества целлюлозосодержащих кормов, синтезируют фермента целлюлазы и разложение целлюлозы в рубце происходит под воздействием различных обитающих в нем микроорганизмов. Целлюлаза наряду с другими ферментами, гидролизующими углеводные полимеры, может быть применена для осахаривания отходов различных производств, использующих растительное сырье. Гидролизованная таким образом масса с повыщенным содержанием более легкоусвояемых углеводов может сама служить кормом для скота, либо использоватьоя для выращивания кормовых дрожжей.

Для поисков продуцентов с полным набором ферментов необходим новый подход к оценке биотехнологичности  ферментов и  выделение с заранее заданными характеристиками. Эти задачи можно решить с помощью современных методов микологии, микробиологии, молекулярной генетики и генной инженерии. В связи с этим необходимо вести исследования по выделению из природы новых высокоактивных грибов, конструированию целлюлолитически активных высокобелковых форм микромицетов методами генной и клеточной инженерии, изучению биотехнологии синтеза ферментов и белка.

Для получения протопластов из клеток микроорганизмов используются  механические или автолитические методы, методы в результате которых создаются условия, задерживающие образование клеточной стенки [1], а также методы, основанные на ферментативном растворении клеточной стенки пищеварительным соком виноградных улиток, насчитывающим более 30 литических ферментов [2] или коммерческими препаратами, выделяемыми из некоторых актиномицетов или грибов базидиомицетов.

Действие этих литических комплексов на оттенку грибов авторы объясняют присутствием λ-1,3–глюканазы, β-1,3–глюканазы, хитизаны, целлюлазы [3].

Применение методов электронной микроскопии позволило проследить основние этапы получения протопластов у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae [4]. Растворение клеточной стенки, как правило, начинается в точке, противоположной рубцу, образующемуся в месте предшествующего почкования. После этого клеточная стенка сползает с клетке, в результате чего остается протопласт, окруженный клеточной мембраной.

Кожиной с соавторами [5] удалось с достаточна эффективностью получить протопласты у ряда дрожжеподобных грибов (кроме Saccharomyces pombe), причем все они, за исключением А.pullulans относятся к аскомицетам. Такие результаты подтверждают уже известные данные о дифференцированном действии различных литических ферментных систем на некоторые группы дрожжеподобных грибов, связанном с различным отроением их клеточных стенок. Низкий выход протопластов у S.pombe обьясняется тем, что, клетки этого гриба богаты λ (1–3) глюканом и для эффективного получения протопластов необходимо обработать клетки смесью ПСУ и λ–и β (1–3) – глюканазы.

В отличие от дрожжей рода Saccharomyces и Candida дрожжи рода Rhodotorula  образуют протопласты при инкубации с улиточным ферментом только после длительного периода инкубации [6]. Исследователи предлагают способ ускорения этого процесса путем суспензирования клетки в смеси либо β-глюкоронидазы (1000 Е/мл) и дриcелазы (по 50 мг/мл) каждого фермента. 

Протопласты бактерий являются более удобной по сравнению с клетками моделью для фундаментальных и прикладных исследований, так как отсутствие такого важного биологического барьера, как клеточная стенка, облегчает слияние протопластов и проникновение в них ДНК.

Багдасарян С.Н. и Авакян З.Т [7] подобрали условия массового образования протопластов у клеток бактерий Bac.thuringiensis, Bac.cepomunoe, Bac.caucasicus и шт. Bac.popieliae. Авторы установили высокую устойчивость вeгетативных клеток Bac.popieliae к действию лизоцима и разработали способ образования протопластов Bac.popieliae с использованием культуральной жидкости Bac.thuringiensis var.galleriae.

Стрижковой А.М. и др. [8] был разработан метод получения протопластов и их регенерация у Вас.polymixa. Исследователями подобраны оптимальные условия для выращивания, максимального выхода и регенерации. Установлено, что антибиотическая активность у 30–40% ревертантов значительно повышается, однако стабильно сохраняется только у 5% проверенных ревертантов.

Интенсивно развиваются такие исследования по изучению образования и регенерации протопластов у стрептомицетов [9].

Так Сугахара с соав. [10] показали, что клеточная стенка стрептомицетов становится более чувствительной к действию литических ферментов, если культуру предварительно выращивать на ореде с ингибирующим рост концентрациями глицина.

Материалы и методы исследований. Материалом  исследований служили виды грибов рода Trichoderma, выделенные из почвы Ташкентской области. С целью изучения возможности получения протопластов у исследумых культур, грибы выращивали глубинным способом на жидкой среде Мандельса в течение 24-48 часов при 30⁰С.

Выросший мицелий, осажденный центрифугированием в стерильных условиях при 3000 об/мин в течение 10 мин. Отмывали от среды сначала 2 раза дистиллированной водой, а затем дважды раствором осмотического стабилизатора. Отмытый мицелий обрабатывали литической смесью.

При изучении влияния литических ферментов на выход протопластов, взятых в опыт культур, в качестве литической смеси для получения протопластов использовали лиофилизированный препарат пищеварительного сока виноградной улитки Helix pomatia (ПСУ) в растворе осмотического стабилизатора (10 мг/мл), лизоцим (10 мг/мл), ферментный препарат, полученный  из культуральной жидкости Streptomyyces afghaniensis - 7 (10 мг/мл), обладающий активностью целлобиазы, протеазы, пектиназы и амилазы, смесь, состоящую из ПСУ (10 мг/мл) и лизоцима (5 мг/мл), смесь ферментного препарата Streptomyyces afghaniensis - 7  (10 мг/мл) и лизоцима (5 мг/мл). Кроме вышеуказанных литических ферментов в работе использовали фермент из Trichoderma lignorum (целлолигнорин). В качестве соматического стабилизатора во всех случаях использовали 0,7 М раствор NaCl. Литическую смесь стерилизовали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,23  мкм и хранили при 5⁰С.

В опытах по изучению влияния осмотических стабилизаторов  на частоту образования  и процесс регенерации протопластов у Trichoderma и Aspergillus в качестве стабилизаторов были  использованы NaCl, KCl, MgSO_4, сахароза, маннит. Все испытанные стабилизаторы были взяты  в концентрации 0,4 и 0,7 М и 0,2 М K-Na фосфатном буфере, рН 6,0-6,2.

Мицелий грибом инкубировали в литической смеси при 30⁰С в течение 4-6 часов. Контроль за образованием протопластов проводили методом световой микроскопии окрашивая клетки слабым водным раствором  метиленового синего. Пробы отбирали каждые 30 мин. В течение всего времени инкубации.

Через 4-6 часов от начала инкубации в литической смеси образовавшиеся протопласты осаждали с помощью центрифугирования, при этом число оборотов снижали до 1000 об/мин., так как протопласты  чувствительны к повышенным нагрузкам. Затем протопласты дважды промывали в растворе осмотического стабилизатора от литической смеси, отделяли от мицелий фильтрованием через стеклянный фильтр №3 и учитывали количество клеток в камере Горяева.

Регенерацию протопластов осуществляли на среде Чапека с осмотическим стабилизатором по методу, в основу которого был положен способ регенерации, предложенный Кожиной с соав.[5].

Проводя несколько последовательных разведений в осмотическом  стабилизаторе, с помощью подсчетов  в камере Горяева определялось число протопластов в исходной суспензии. В дальнейшем использовалась суспензия с концентрацией 10⁶  протопластов в 1 мл. 0,25 мл суспензии вливали в 50 мл теплой растопленной среды Чапека с осмотическим стабилизатором, эта смесь разливалась на поверхность 5 чашек Петри с заранее разлитой средой того же состава. Эта среда должна обеспечить регенерацию клеточной стенки. Для контроля то же количество протопластов  высевали непосредственно на поверхность среды Чапека, не содержащей осмотического стабилизатора. Число регенерирующих протопластов выражали в процентах от числа протопластов в суспензии.

Результаты исследований и обсуждение. Целью этой  части нашей работы явилось изучение возможности применения  к различным микроскопическим грибам рода Trichoderma методики, ранее использованной для дрожжей-сахаромицетов и обеспечивающей высокоэффективное получение протопластов у этого объекта [11].

Первые опыты по получению протопластов  микроскопических грибов проводили с мицелием 24 часового возраста. Под влиянием пищеварительного сока улитки (ПСУ) в течение 12 часов микроколонии культур распадались на отдельные короткие фрагменты. Однако, в большом количестве сохранились более длинные гифы, которые были сегментированы на темные и светлые участки разной величины.

Через 24 часа инкубации с ПСУ отмечается дальнейший распад мицелия на короткие фрагменты и некоторое увеличение сегментированных участков. Через 36 часов и далее распад мицелия увеличивался, но не все фрагменты его превращались в сферические формы – протопласты.

Таким образом, под влиянием ПСУ происходит распад мицелия у грибов на отдельные фрагменты различных размеров, из которых формируются протопласты. Особых различий в формировании протопластов у опытных культур мы не наблюдали. В основном  тот процесс по морфологии был одинаков. Для дальнейших исследований нами была взята культура Trichoderma harzianum.

После образования протопластов проводили регенерацию клеточной стенки. На основании полученных результатов нам не удалось с достаточно высокой эффективностью получить протопласты у опытных культур.

Таблица 1.

Результаты опытов по получению и регенерации протопластов грибов рода Trichoderma

Оптимальной температурой для образования протопластов является температура  28-30⁰С. При 35-37⁰С у исследованных культур протопласты не образовывались, так как наблюдался лизис мицелия. При более низких температурах 5-10⁰С изменение мицелия наступало очень медленно и требовалась более длительная экспозиция (5-7 дней).

В работе было изучено влияние стабилизаторов на образование протопластов из 24-часового мицелия. В качестве стабилизаторов использовали сорбит, маннит и калий хлор. Лизис мицелия продолжался 24 часа.

Таблица 2.

Влияние стабилизаторов на выход протопластов у культур рода Trichoderma

На стабильность протопластов заметно влияет реакция суспензирующий среды. В наших опытах оптимальным для стабильности протопластов оказался рН 6,6-6,7. В дальнейших исследованиях нами для получения протопластов были испытаны различные лизирующие ферменты и их смеси (табл). ПСУ добавляли в  количестве 1 мл, целлолигнорин и целлоафганин-10 мг/мл.

Таблица 3.

Влияние состава лизирующий смеси на образование протопластов гриба Trichoderma harzianum (температура 28⁰С)

После 12-ти часового лизиса 24-х часового мицелия отмечено наибольшее образование протопластов в тех вариантах, в состав которых входил целлолигнорин, целлоафганин+ПСУ. При лизисе 48-ми часового мицелия гриба протопласты были обнаружены в меньшем количестве. Более медленное образование протопластов в этом случае, вероятно, связано с возрастными изменениями в клеточной стенки  гриба.

Таким образом, описанным методом нам удалось получить протопласты у ряда микроскопических грибов рода Trichoderma.

Установлено, что оптимальными стабилизаторами при образовании протопластов у испытанных культур являются сорбит и маннит.

Наиболее активной лизирующий системой, позволяющей получать стабильные протопласты является система, состоящая из ПСУ, целлолигнорина и целлоафганина.

Список литературы:
1. Foury F., Goffen A. Combination of 2-deoxy-D-glucose and snailgut enzyme treatments for preparing spheroplaste of Sohizo saccharomyces pombe. // J. Gen. Microbiol. 1973. V.75. N 1. P.227-229
2. Стенько А.С., Бескоровайная Н.К. Получение и регенерация протопластов Streptomyces griscus. // Микробиол. ж. I983. T.45. Н 2. С. 29-33
3. Nayak K.K., Padbidri A.Y., Hirlekar M.G., Pandley N.K. A rapid method for preparation of Rhodotorula glutinis. // Curr. Sci. India. -1986. V.55. N 18. P.926-927
4. Багдасарян С.Н., Авакян З.Т Ополучении протопластов энтомопатогенных бактерий Вас. popiliae и Вас. thuringiensis // Биол. Армении. Ереван. 1985. № 3. рук. Деп. в ВИНИТИ, 14 авг. № 6017-85 (Деп).
5. Deshpande M.V., Balkrishnan H., Ranjukar P.K , Shankar V. Isolation and immobilization of Sclerotium rolefsii protoplasts. // Biotechnol. Lett. 1987. V. 9. N.1. P.49-52
6. Longley R.R., Rose A.H., Kniths B.S. Composition of the protoplast membrane from Saccharomyces cerevisiae. // Biochem. J. 1968. V. 108. N. 3. P. 401-412
7. Кожина Т.Н., Мироненка Н.В. и Чепурная О.В. Получения и регенерация проторластов у дрожжеподобных грибов. // Микол. и фитопатол. I983.Т.17. Вып. 3. С. 248-251
8. Стрижкова А.М., Осничук Л.Ф., Мацелюх Б.П., Кравец О.М., Богацкий М.А., Евсеева Р.А. Селекция Вас.polymixa методом протопластирования. //Персп. создания лекарств. средств с использ. биотехн. Тезисы докл. Всесоюзн. конф. Москва 20-21 ноября. М. I985. С-30
9. Okanischi M., Suzuki., Umesave M. Formation and reversion of Streptomycete protoplasts culture condition and morghological study.//J.Gen.Microbiol., 1974.V.80.N.2.P.389-400
10. Sugoracha G., Fucni K., ota F.et al. Rapid formation of protoplast of S.griseoflavus and their fine structure. //Jap.J.Microbiol. 1971. V. 15.N.1. P. 73-84.
11. Кожина Т.Н., Чепурная О.В. Слияние протопластов как метод получения гибридов у дрожжей – сахаромицетов.//Генетика, I980. Т.16. №2. С.360-363