Изучение макро и микронутриентов цист артемии Аральского моря

АННОТАЦИЯ

Представлены результаты изучения макро- и микронутриентов цисты Artemia parthenogenetica Аральского моря (А. моря), измельчённой до 40 мкм. Установлено содержание общего белка (49,2%), жира (15,8%) и углеводов (30,6%). Методом ВЭЖХ определено количество водорастворимых витаминов В1, В2, РР, В6, С. Методом ИСП-МС установлено содержание 29 макро- и микроэлементов.  Показано высокое содержание эссенциальных макро- (К, Са, Мg, Na, Р) и микроэлементов (Fe, Zn и Se). Особо токсичные элементы кадмий, свинец и мыщьяк отсутствуют или находятся в пределах, допустимых нормой.    

ABSTRACT

The results of the study of macro- and micronutrients of the Aral Sea (A. sea) cysts Artemia parthenogenetic, crushed to 40 microns are presented. The content of total protein (49.2%), fat (15.8%) and carbohydrates (30.6%) was determined. The amount of water-soluble vitamins B1, B2, PP, B6, C was determined by HPLC. ICP-MS determined the content of 29 macro- and microelements.  A high content of essential macro- (K, Ca, Mg, Na, P) and micro-elements (Fe, Zn, and Se) is shown. The especially toxic elements cadmium, lead and mousy are missing or are within normal limits.

Ключевые слова: циста, Артемия, макро- и микронутриентов, белок, липид, углевод, витамин, макро-и микроэлементы, масс-спектрометрия, Аральское море.

Keywords: cysts, Artemia, macro- and micronutrients, protein, lipids, carbohydrate, vitamin, macro- and microelement, mass spectrometry, Aral Sea

Введение

Экологический кризис Приаралья, аридизация, загрязнение окружающей среды, низкий уровень профилактической медицины являются серьезными угрозами для здоровья местного населения, приводящими к распространению инфекционных, обострению хронических заболеваний и резкому снижению иммунитета человека.

Для минимизации негативных антропогенных факторов, во всем мире специалистами ведется активное изучение лечебного и профилактического действия нутрицевтиков и лекарственных средств на основе природного сырья растительного и животного происхождения.

Статистические данные доказывают, что оптимальное питание, которое будет включать сбалансированное соотношение макро- и микронутриентов, окажет существенное влияние на изменение и сохранение здоровья населения в целом.

Одним из перспективных сырьевых источников для получения БАДов, премиксов, нутрицевтиков в Каракалпакстане становятся цисты рачка Artemia parthenogenetica, которые были обнаружены в акватории А. моря в конце 20 века [2, c. 42; 3, с. 62], и сейчас, вследствие высокой минерализации водной среды, стали единственным, успешно размножающимся видом в А. море, запасы которого в настоящее время достигают промысловых объемов.

Особую ценность представляют цисты, которые как известно, содержат высокий уровень полноценного белка, весь комплекс незаменимых аминокислот, водо- и жирорастворимых витаминов, легкоусвояемых липидов, полиненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементов, стимуляторов роста, антиоксидантов, что позволяет создать широкий ассортимент биопродуктов.

Достоверно известно из литературных данных, что благодаря высоким адаптационным свойствам, Артемия может динамично менять внешние признаки, и в особенности биохимический состав в зависимости от таких факторов как место обитания, качество пищи, время сбора [1, c. 6-23]. Учитывая эти особенности и широкие возможности местного сырья – возникает необходимость тщательного и сравнительного исследования его химических составных, их оценки в качестве источников природных нутрицевтиков.

Целью исследования является количественное изучение макро- и микронутриентов цист рачка Artemia parthenogenetica А. моря.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись цисты рачка артемии, собранные осенью 2018 г. с побережья А. моря, предварительно обессоленные (промытые от морских солей на его поверхности), измельченные на шаровой мельнице до размера частиц 40 мкм, при влажности 5,1 ± 0,2%.  Полученная мука цист представляет собой порошок темно-коричневого цвета, со специфическим рыбным запахом.

Макронутриенты.

Одним из основных макронутриентов цисты являются белки, липиды и углеводы.

В муке цист артемии, общие липиды определяли экстракцией смесью хлороформ-метанол (2: 1, об/об.) по методу Folch et al. (1957) [4, с. 497-509], количество общего белка - по методу Кьельдаля [5, с. 22-27], определение количества общего сахара проведено фенол-сернокислотным методом [6, с. 350-356] и золы по ГОСТу 26226-95 [7].

Микронутриенты

Водорастворимые витамины определяли методом ВЭЖХ [8, с. 315-324] в обращенно-фазовом, ион-парном варианте, в изократическом режиме со спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию витаминов определяли по площади пика при соответствующих длинах волн спектрофотометрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Для определения градуировочного коэффициента готовили серию калибровочных растворов (не менее 5) тиамина и пиридоксина с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/мл, рибофлавина с концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл, аскорбиновой кислоты с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/мл.

ВЭЖХ- анализ стандартных растворов витаминов и испытуемых образцов проводили на колонке Zorbax SB-C18 (4,6 х 75 мм), 3,5µm. Буфер А: 0.05 М раствор KH₂PO_4, pH-2,5; В: CH₃CN. Программа градиента - 0,6% В 0-0,5мин; 6% В – 4 мин; 30% В – 12 мин, 60% В – 16 мин. Скорость потока 1 мл/мин, поглощение 254 нм.

Количественное определение микро- и макроэлементов проведено с помощью метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), позволяющей одновременно определять почти все химические элементы с низкими пределами обнаружения и широким диапазоном концентрации в рамках одного измерения [9, с. 45-57].

Навеску сухой пробы исследуемого вещества 0,0500-0,5000 г взвешивали на аналитических весах и помещали в тефлоновые вкладыши, добавляли соответствующие количества очищенных концентрированной минеральной кислоты (азотной кислоты (х/ч) и перекиси водорода (х/ч).  Сосуды помещали в автоклавы, закрывали и ставили на прибор микроволнового разложения Berghof c программным обеспечением MWS-3+. Определяли программу разложения исходя из типа исследуемого вещества, указывали степень разложения и количество автоклавов (до 12 шт).

После разложения содержимое в автоклавах количественно переносили в 50 или 100 мл мерные колбы и доводили объем до метки с 0,5% азотной кислотой.

Анализ исследуемого вещества проводили на приборе – оптико-эмиссионный спектрометр с индуктивно связанной аргоновой плазмой (ОЭС с ИСП). В методе определения указывали оптимальную длину волны определяемых микро- или макроэлементов, при которой они имеют максимальную эмиссию. В построении последовательности анализов указывали количество в мг и степень его разведения в мл. После получения данных, прибор автоматически вычисляет количественное содержание вещества в исследуемом образце и вводит в виде мг/кг или мкг/г с пределами ошибки и RSD в %.

Определение количества общего сахара фенол-сернокислотным методом предусматривает построение калибровочной кривой по РСО глюкозы. Стандартный раствор глюкозы (1мг/мл) готовили в мерной колбе, растворяя 100мг глюкозы в 50мл H₂O и далее доведя водой до метки (100мл). Методом разбавления исходного раствора были получены растворы разной концентрации для построения калибровочной кривой.

Для определения общего количества сахара фенол-сернокислотным методом к 0,5 мл стандартных образцов глюкозы концентрации 10, 20, 40, 80, 100, 120 мкг/мл и исследуемому раствору добавляли по 0,5мл 5% раствора фенола и 2,5 мл конц. Н₂SO_4. Определяли показания светопоглощения оптического прибора (спектрофотометра) при длине волны 480 нм и температуре 10⁰С.

Результаты исследования и их обсуждение

Ценность любого пищевого продукта заключается в его способности удовлетворять потребность организма в белках, незаменимых аминокислотах, липидах, углеводах, витаминах, макро- и микроэлементах. В работе проведена оценка количественного содержания макронутриентов (углеводов, липидов, белка) мукообразного образца цисты артемии А. моря.

При определении содержания общего количества сахара фенол-сернокислотным методом была построена калибровочная кривая стандартных образцов глюкозы различной концентрации. Калибровочная кривая и уравнение линии тренда приведены на рис.1.  

Количество общего сахара в исследуемом образце водного экстракта муки цисты Аральского моря, определенное калибровочной кривой по глюкозе и рассчитанное по уравнению, соответствует 30,6 ± 0,2 %.

Рисунок 1. Калибровочная кривая для определения количества глюкозы фенол-сернокислотным методом

Для оценки белковой ценности нашего образца, мы провели анализ литературных данных по содержанию белка в основных пищевых продуктах.

Согласно этим данным, максимальное содержание отмечается в сое (34-35%), говядине (19-22%), баранине (16-21%). В рыбных и других морепродуктах содержание белка колеблется в пределах 10-22%.  Причем, при содержании белка в пределах 10-13%, рыба классифицируется как малобелковая, а выше - как высокобелковая. Так, например, самое высокое содержание белка до 32% присутствует в икре осетровых.

Как видно из таблицы 1, содержание белка в цисте составляет примерно 50%. Высокое содержание белка в цисте артемии А. моря характеризует продукт как высокобелковый сырьевого продукт, который можно использовать для дополнительного обогащения рациона белком и незаменимыми аминокислотами.

О биологической ценности продуктов питания также судят по их липидному компоненту. Так, например, запасные жиры в растениях аккумулируются в основном в семенах.  Для   зерновых культур содержание жира в семенах составляет в среднем: 2 - 6%.  Масличные культуры содержат значительно больше жиров: подсолнечник 30 - 50%, соя 20 - 30%, клещевина 50 - 60%. Учитывая, что циста по своей природе является морепродуктом, проведено сравнение количественного содержания жира (около 16%) с данными для рыб. Жирность рыб колеблется в весьма широких пределах от 0,5 до 20 %. Обычно ее по жирности разделяют на группы: нежирная — до 5 %, среднежирная 5—15 % и жирная, свыше 15 %.

По результатам анализа нашего образца по количественному содержанию жиров (липидов) циста относится к группе жирных продуктов среди рыб, а сравнительно с растениями приближена к масличной культуре сое – продукции средней жирности.

В таблице 1 приведены определенные количественные показатели макронутриентов цисты Артемии А. моря [4-7].

Таблица 1.

Количество макронутриентов цисты артемии А. моря

(М±n, n=3), %

Как видно из результатов анализа, цисты артемии по своим количественным показателям макронутриентов можно отнести к числу ценного природного сырья в качестве источника получения белка, жира и углеводов.

Не менее важными компонентами продукта питания являются и микронутриенты: витамины, макро- и микроэлементы.

Согласно требованиям и методикам Государственной фармакопеи, при анализе каждый витамин определяется отдельно. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – один из самых популярных методов определения водорастворимых витаминов, благодаря возможности одновременного определения сразу нескольких соединений. Но одновременное определение всех водорастворимых витаминов в изократическом варианте затруднительно. Решить данную проблему можно, используя либо ион-парные реагенты, либо градиентное элюирование. Для одновременного определения нескольких витаминов традиционно используется вариант ион-парной хроматографии.

Извлечения водорастворимых витаминов из муки цисты артемии проводили дистиллированной водой при комнатной температуре и перемешивании в течение 2-х часов. Центрифугированием отделяли экстракт от осадка.

При анализе водорастворимых витаминов цисты артемии А. моря массовую концентрацию витаминов определяли по площади пика при соответствующих длинах волн спектрофотометрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов витаминов (тиамина, пиридоксина, рибофлавина и аскорбиновой кислоты).

На рисунке 2 представлена хроматограмма смеси исследуемых стандартных витаминов и время их удерживания в аналитической колонке.

Рисунок 2. ВЭЖХ- анализ стандартной смеси водорастворимых витаминов на колонке 4,6 х 75 мм Zorbax SB-C18, 3,5µm. Буфер А: 0.05 М раствор KH₂PO₄ pH-2,5; В:CH₃CN. Программа градиента - 0,6% В 0-0,5мин; 6% В 4мин; 30% В 12мин. Скорость потока 1мл/мин, поглощение 254 нм.

Проведенный анализ показал наличие витаминов В1, В2, В6, РР, С. Полученные данные по содержанию водорастворимых витаминов представлены в таблице 2. 

Таблица 2.

Количество водорастворимых витаминов цисты артемии

А. моря мг/кг (М±n, n=3)

Минеральные вещества наряду с белками, жирами, углеводами и витаминами являются жизненно важными компонентами пищи человека, необходимыми для построения структур живых тканей и осуществления биохимических и физиологических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма. Кроме того, элементный состав природных объектов может также отражать воздействие окружающей среды и определять уровень их экологической чистоты, способности накапливать токсические элементы, для оценки качества и безопасности применения в качестве биопродуктов [11, с. 79-84].

Для получения достоверной информации об элементном составе цисты артемии А. моря был использован метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС). Это современный, эффективный, высокочувствительный метод анализа, способный определять одновременно почти все химические элементы с низкими пределами обнаружения и широким диапазоном концентрации в рамках одного измерения [9, с. 45-57].

Изучение элементного состава цисты артемии и его золы показало наличие 29 элементов. Среди них, в наибольшем количестве содержатся эссенциальные (жизненно-важные для человека) макроэлементы, такие как К, Са, Мg, Na, Р, а из эссенциальных микроэлементов следует отметить высокое содержание Fe и Zn.

Особо следует отметить наличие среди них селена (Se). Новейшие результаты научных исследований показали, что селен является одним из наиболее перспективных антиканцерогенных факторов пищи [10, с. 34-42].

Среди микроэлементов присутствуют и условно-эссенциальные (жизненно-важные, но вредные в определенных дозах) - (As), (Ga), (Li), (Ni), (Si), (V), (Cs), токсичные - (Al), (Ba), (Be), (Bi), (Cd), (Pb), (Tl) и потенциально-токсичные микроэлементы - (Ag), (Rb), (Sr).

Для оценки экологической чистоты цист особое значение имеют результаты определения в них особо токсичных металлов, таких как кадмий, свинец и мышьяк. Результаты проведенных исследований показали отсутствие кадмия в муке цисты и невысокое содержание остальных особо токсичных элементов. 

В таблице 3 отражены данные, полученные при анализе, для измельченной (муки) цисты и золы.

Как видно из результатов анализа, содержание макро-  и микроэлементов в муке цист достаточное для обеспечения суточной потребности организма.

Содержание тяжелых и особо токсичных металлов в исследуемом образце находится в пределах допустимых норм.

Таблица 3.

Количество макро- и микроэлементов цисты артемии А. моря (М±n, n=3)

Таким образом, цисты артемии Аральского моря в виде мукообразного порошка включают в себя все основные виды макро- и микронутриентов – белки, углеводы, липиды, водорастворимые витамины, макро- и микроэлементы в достаточно большом количестве, и могут послужить сырьевым источником для создания нутрицевтиков.

Список литературы:

1.  Rudneva. I.I. Artemia Prospects for use in the national economy// Kiev naukova dumka (1991) 6-23
2. Brad Marden, Gilbert Van Stappen, Ablatdyin Musaev, Iskandar Mirabdullayev, Iliya Joldasova, Patrick Sorgeloos. Assessment of the production potential of an emerging Artemia population in the Aral Sea, Uzbekistan// Journal of Marine Systems 92 (2012) 42–52
3. Musaev A.K., Abdurahimova A.H., Mirabdullaev I.M. Quality of cysts of Artemia of the Aral// Вестник Каракалпакского отделения Академии наук Республики Узбекистан. №1, 2012-г, 62-64
4. Folch J., Lees M., Stanley G.H., 1957, A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues// J. Biol. Chem. 226, 497-509
5.  Khajibayev Q. G’., Olimjonov Sh.S., Oshchepkova Y.I., Berdimbetova G.E. Determination of the quality and chemical composition of the Aral Sea Artemia cysts// Science and Education in Karakalpakstan 2018 №4 22-27
6.  Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A., Smith F. Colorimetrik method for determination of sugars and reiated substances// Analyt. Chem. 1956.V.28.P.350-356.
7. ГОСТ 26226-95. Межгосударственный стандарт.  Методы определения сырой золы.
8. Бендрышев А.А., Пашкова Е.Б., Пирогов А.В., Шпигун О.А. Определение водорастворимых витаминов в витаминных премиксах, биологически - активных добавках и фармацефтических препаратах методом ВЭЖХ с градиентным элюированием// Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. Т. 51. №4 315-324стр.
9. Смирнова Е. В., Зарубина О. В. Определение Макро- и микроэлементов в биологических стандартных образцах растительного и животного происхождение методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой// Стандартные образцы 2014г. №3 45-57стр.
10. Полянская И.С. Новая классификация биоэлементов в биоэлементологии// Молочно-хозяйственный вестник, №1(13), 1кв.2014
11. Слепян., Ивановна Л.К., Евгеньевна И.Г., Николаевна О.П., Сергеевна Н.В., Александровна М.Я., Владимировна М., Шантырь И.И. Биоэлементы в листьях тропических лекарственных растений Polyscias filicifolia (Moore ex Fournier) Bailey(Araliaceae), Ginkgo biloba L (Ginkgoaceae) и биологически активных добавок// butlerov.com © Butlerov Communications. 2014.Vol.37. No.3. P.79-84