Фланорин как эффективное гепатозащитное и иммуномодулирующее средство у животных с поражением печени четыреххлористым углеродом

АННОТАЦИЯ

В статье детально рассмотрены вопросы, связанные с определением гепатозащитных и иммуномодулирующих свойств фланорина в отношении  животных, имеющих поражённую печень четырёххлористым углеродом. Была установлена фармакотерапевтическая эффективность фланорина, а также его иммунотропное действие  фланорина, в сравнении с силибором, в условиях токсического поражения печени.

ABSTRACT

The article deals with issues in detail related to the determination of hepatoprotective and immunomodulating properties of flanorin in relation to animals with liver damage of carbon tetrachloride. The  flanorin pharmacotherapeutic effectiveness has been established, as well as its immunotropic effect of flanorin in comparison with silibor in conditions of toxic liver damage.

Ключевые слова: флавоноидный препарат, гепатопротекторное действие, интактные животные, полифенольные соединения, гипопротеинемия, желчесекреторные процессы, маркеры синдрома цитолиза гепатоцитов, метаболические процессы в печени.

Keywords: flavonoid medicine; hepatoprotective effect; intact animals; polyphenol compounds; hypoproteinemia; bile secretory processes; markers of hepatocyte cytolysis syndrome; liver metabolic processes.

Фланорин суммарный флавоноидный препарат, выделенный из Vexibia (Pseudosophora) alopecuroides (L.) Yakov.,  содержит в своем составе глаброл, вексибинол, вексибидин, лютеолин и другие соединения этого ряда. Его стандартизация проводится по лютеолину, которого должно быть не менее 0,2%  (метод ВЖХ) [1, 2]. Учитывая, что многие лекарственные препараты, содержащие флавоноиды и близкие к ним по структуре полифенольные соединения, обладают выраженным гепатопротекторным действием [3] представляло определенный интерес рассмотреть в этом плане фланорин, особенно в сравнительном аспекте с уже известными средствами, используемыми при поражении гепато-билиарной системы. В качестве модели оценки фармакотерапевтического  эффекта фланорина при патологии печени выбрано ее поражение четыреххлористым углеродом, являющимся довольно сильным гепатотропным ядом [4]. Референс препаратом в проводимых экспериментах служил силибор, содержащий сумму флавонлигнанов (силибина, силидионина, силихристина,) и флавонолов (таксифолина и кверцетина) [5,6].

Материалы и методы исследования.

Эксперименты по изучению гепатозащитного действия фланорина выполнены на белых крысах-самцах массой 180 – 200 г., которым на протяжении 5 суток этот препарат вводили ежедневно орально в дозе 50 мг/кг в виде водной эмульсии с абрикосовой камедью, Аналогичным образом крысам вводили препарат сравнения силибор в дозе 200 мг/кг. На 6-^ые сутки всем животным для воспроизведения острого токсического поражения печени вводили однократно, также внутрижелудочно 50% масляный раствор четыреххлористого углерода (CCL₄)  в дозе 1 мл на 100 г массы тела [7], а через 2 часа последний раз крысам давали тестируемые препараты. Контрольные животные получали (CCL₄)  и эквиобъемное с вводимыми препаратами количество водной абрикосовой камеди. Параллельно имелась также группа интактных животных. Все животные содержались в обычных условиях вивария с соблюдением правил принятыми международной конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986).

О фармакотерапевтической эффективности фланорина судили по содержанию в сыворотке крови крыс (забивали мгновенной декапитацией под легким эфирным наркозом) общего белка, активности аланин – и аспартатаминотрансферазы (АлАТ и АсАт) щелочной фосфотазы  [8]. Непосредственно в ткани печени определяли содержание гликогена [9], молочной и пировиноградной кислот (МК и ПВК) [8], малонового диальдегида (МДА) [10]. Окислительно-восстановительный потенциал системы МК – ПВК рассчитывали по [11]. У части крыс, находящихся под наркозом находящихся под наркозом (1% раствор барбамила в дозе 1,0 мл на 100 г. Массы, внутрибрюшинно), через катетр вставленный в общий желчный проток, собирали желчь часовыми порциями в течение 4 часов. В собранной желчи определяли концентрацию желчных кислот [12], холестерина [13] и билирубина [14] и рассчитывали их общее содержание.

Для оценки иммунотропного действия  фланорина (в сравнении с силибором) в условиях токсического поражения печени использовали мышей – самцов массой 19 – 20 г. СCl₄ в этом случае им вводили ежедневно подкожно в течение 3^х суток в виде 20% масляного раствора по 0,2 мл [15]. В день последнего введения ССl₄ животных иммунизировали эритроцитами барана (2 х 10⁸ на мышь)  и еще раз через 5 дней определяли число антителобразующих клеток (АОК) в селезенке по методу [16]. Фланорин и силибор  вводили в вышеуказанных дозах на всем протяжении эксперимента.

Одновременно с определением количества АОК в селезенке подсчитывали общее количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (селезенка, брыжеечные лимфатические узлы) обще принятым методом.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t - критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Как видно из табл. 1, у крыс с острым токсическим поражением печени ССl₄ в сыворотке крови развивалась  гипопротеинемия – содержание общего белка уменьшалось на 13,9%. При этом активность ферментов маркеров цитолиза гепатоцитов (АлАТ и АсАТ) повышалось на 277,1% и 58,1% соответственно. Существенным звеном в патогенезе поражения печени различными гепатотоксинами является холестаз. На его выраженность в проводимых экспериментах указывал рост активности желчной фосфатазы и нарушение желчеобразования (табл. 1). Применение фланорина способствовало уменьшению выраженности гипопротеинемии (содержание белка было выше, чем в контроле на 12,95 и почти не отличалось от его уровня у интактных животных). Значительно понижалась активность АлАТ и АсАТ (на 65,7 и 25,6% соответственно). На фоне введения фланорина показатели, характеризующие выраженность холестаза также имели явную тенденцию к нормализации.

Введение крысам ССl₄ способствовало резкому снижению содержания гликогена в печени (на 54,4%), повышению содержания МК на 57,6% и снижению ПВК на 40.5%. В результате ОВП системы МК – ПВК уменьшался на 13 мВ, что свидетельствовало об ухудшении процессов  аэробного окисления углеводов и соответственно уменьшению энергопродукции в клеточных системах. У животных, получавших ССl₄,  выявлено также значительное увеличение содержания в печени одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) – малонового диальдегида.

Введение животным фланорина способствовало поддержанию на достаточно высоком уровне содержания гликогена в печени (ниже интактного уровня всего на 7,5%), практически восстанавливало до нормы ОВП МК/ПВК (разница с интактными животными составляла 2,2 мВ) ингибировало процессы ПОЛ (содержание МДА ниже, чем в контроле на 54,3%). Последнее обстоятельство, по-видимому, связано с выраженной антиоксидантной  активностью некоторых, входящих в состав фланорина флавоноидов [17].

Интенсивность секреции желчи  у крыс, получавших перед введением ССl₄ фланорин, нарушалась менее значительно (табл.1). В результате у контрольных крыс общее количество желчи,  выделенное за 4 часа опыта, было ниже чем у интактных животных на 35,5%, а у получавших тестируемый препарат это снижение составляло только 1,4%. Под действием фланорина происходили положительные сдвиги и в химическом составе желчи, у крыс опытной группы превышало контрольные значения на 140,6%. При этом отмечено также восстановление экскреции холестерина. Крайне благоприятно сказалось предшествующее токсическому воздействию ССl₄ на печень введение фланорина и на печеночном звене обмена билирубина.

Сравнение фланорина в проведенных экспериментах с силибором показало его определенные  преимущества по влиянию на метаболические процессы в печени и особенно по влиянию на желчесекреторные процессы.

В связи с тем, что при токсическом гепатите развивается  вторичные иммунодефицитное состояние, а для флавониодов описано существенное иммуностимулирующее действие [18], в работе также проведен анализ влияния фланорина (в сравнении с силибором) на процессы первичного антителообразования у животных пораженных ССl_4. Об изменениях в этой сфере судили   по образованию антителообразующих клеток  в селезенках мышей в ответ на введение им тимус – зависимого антигена – эритроцитов барана.  Из таблицы 2 видно, что в селезенках мышей пораженных ССl_4, образуется  АОК на 82,9% меньше, чем у интактных животных. Под действием ССl₄ применение фланорина  реакции иммунитета сохранялись на повышенном уровне – число АОК в селезенках животных с острым токсическим поражением печени по сравнению с контролем увеличивалось в 5,3 раза и оставалось ниже этого показателя у интактных животных всего на 9,6%. Сходные результаты получены и при расчете числа АОК на 1 млн спленоцитов. Полученные данные свидетельствуют как о  гепатозащитной активности фланорина, так и о способности предотвращать нарушения в иммунной системе, вызываемые ССl₄. При этом следует отметить, что фланорин не только стимулирует специфическую  иммунологическую реактивность на антигенный стимул, но и активизирует пролиферативные свойства клеток селезенки. У животных с острым токсическим поражением печени ССl₄ также отмечено заметное снижение общего количества клеток в тимусе, костном мозге и брыжеечных лимфатических узлах на 55,3; 52,9 и 37,9% соответственно. Введение фланорина практически полностью восстанавливает число клеток этих органов. Силибор в плане поддержания иммунологического состояния организма на должном уровне при интоксикации мышей действовал аналогично фланорину, хотя в этом случае (как и при сравнительной оценке их гепатозащитного действия) его эффект был выражен слабее (табл.2).

 Таким образом, фланорин можно рассматривать как эффективное гепатозащитное средство при его остром токсическом поражении печени ССl₄. При его предшествующем введении не развивается гипопротеинемия, не наблюдается резкого повышения активности ферментов сыворотке крови – маркеров синдрома цитолиза гепатоцитов и холестаза, поддерживается на уровне близком к интактным животным углеводный обмен и процессы ПОЛ. Фланорин предупреждает нарушение секреции желчи, процесса синтеза желчных кислот, обмена билирубина и выделение холестерина, индуцируемые ССl₄. Фланорин в условиях вторичного иммунодефицита развивающегося при поражении печени ССl₄ стимулирует иммунореактивность организма. По своей эффективности в рассматриваемых  аспектах  фланорин не уступает силибору, а в ряде случаев оказывает более выраженное действие.

Выводы:

1. Фланорин вводимый в превентимном режиме, в значительной степени ограничивает проявление  гепатотоксичности четыреххлористого углерода, нивелирует  метаболические нарушения  в печени и поддерживается на должном уровне  ее функциональная активность.
2. Фланорин восстанавливает иммунологическую активность организма при вторичном иммунодефицитном состоянии, формирующемся  после введения животным четыреххлористого углерода.
3. По гепатозащитной и иммуностимулирующей активности в условиях поражения печени четыреххлористым углеродом, фланорин имеет определенные преимущества перед силибором.

Список литературы:

1. Халилов Р.М., Маматханов А.У., Сотимов Г.Б., Маматханова М.А. Разработка технологии получения фланорина из Pseudosophora alopecuroides // Химия растительного сырья– Барнаул, 2009.–С. 93 – 96.
2. Котенко Л.Д., Эргашева Ш.А., Халилов Р.М., Максумова Д.К. ,Маматханов А.У. Стандартизация  корней с корневищами псевдосо-форы лисохвостной (Pseudosophora alopecuroides) // Фармацевтический журнал. – Ташкент, 2017. - № 3.- С. 66 – 70.
3. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина Р.А., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. – Новосибирск: Академическое изд-во «Гео», 2007, - 232 с.
4. Абдуллаев Н.Х. Патохимия и патогенетическая терапия хронических гепатитов и цирроза печени. – Ташкент: Медицина. – 1968. – 244 с.
5. Sannenblicher J. Flavonoids and biolavonoids. – Budapest: Medica, 1982. – p. 475 – 478.
6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. -  Москва, РИА “Новая волна”,  2008. – С. 526 – 529.
7. Сальников  В.В., Савченко А.Г., Гужева Н.Н., // Украинская респ. конф. по актуальным вопросам гастроэнтерологии 8-я: Тезисы докладов. – Днепропетровск, 1987. С. 38 -39.
8. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - М.: МЕД пресс информ, 2009. – 896 с.
9. Lo S., Rusell J.C., Taylor A.W. Determination of glycogen in small tissue samples // J. Appl. Physiol.- 1970.- Vol. 28 (2).- Р. 234-236.
10. Стальная И. Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малоно­вого диальдегида с помощью тиобарбнтуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича.- М.: Медицина, 1977.- С. 66-68.
11. Райскина М.Е., Онищенко Н.А., Шаргородский Б.М. и др. Методы прижизненного исследования метаболизма сердца /Под ред. М.Е. Райскиной. - М.: Медицина, 1970.- 264 с.
12. Карбач Я.И. Количественное определение желчных кислот в желчи и крови с применением хроматографического метода // Биохи­мия.- 1961.- Т. 26, N 2.- С. 305-309.
13. Дроговоз С.М. Нарушение интенсивности желчеотделения и химического состава желчи при дистрофии печени, вызванной четы­рех хлористым углеродом // Вопр. мед, химии.- 1971.- N 4.- С. 397-400.
14.  Скакун Н.П. Нейро-гуморальный механизм желчегонного действия инсулина // Пробл. эндокринол. - 1956. - N 6.- С. 75-80.
15. Материалы по экспериментальному (фармакологическому) испытанию иммуномодулирующего действия , фармакологических средств/ Р.В. Петров  др. – Москва, 1984. – 35 с.
16. Jerne N.K., Nardin A.A. Plague forma in agar by single antibody – producing cells. - Selence.- 1963.- Vol. 140 – p. 405 - 407.
17. Хушбактова З.А., Юсупова С.М., замараева М.В., Таджибаева Э.Т.,  Сыров В.Н., Батыров Э.Х., Юлдашев М.П. Взаимосвязь структуры и антиоксидантной активности некоторых флавоноидов из растений центральной азии. – Химия природ. соедин. – 1996. - №3. – С. 350 – 357.
18. Сыров В.Н., Батырбеков А.А., Киличева Г.Х., Иммуномодули-рующие свойства флавоноидов из флоры среднеазиатского региона.