Международный
научный журнал

Сравнительная характеристика выхода глутатиона из различных типов клеток


Comparative characteristics of the leaving of glutathione from cells of different types

Цитировать:
Меланова Н.Р. Сравнительная характеристика выхода глутатиона из различных типов клеток // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2019. № 5(59). URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/7220 (дата обращения: 05.07.2020).
 
Прочитать статью:


АННОТАЦИЯ

Глутатион (GSH) – это трипептид (γ-глутамилцистеилглицин), который является основным свободным тиолом и низкомолекулярным антиоксидантом в большинстве живых клеток. В работе впервые продемонстрировано, что значительные количества внутриклеточного глутатиона вбрасываются из цитозоля тимоцитов, человеческих эритроцитов и раковых клеток меланомы во внеклеточную среду как в нормальных изотонических условиях среды, так и при воздействии гипоосмотического стресса.

ABSTRACT

Glutathione (GSH) is a tripeptide (γ-glutamylcysteylglycine), which is the main free thiol and low molecular weight antioxidant in most living cells. It was for the first time demonstrated that significant amounts of intracellular glutathione are transferred from the cytosol of thymocytes, human erythrocytes and cancer melanoma cells to the extracellular environment both under normal isotonic environmental conditions and under the influence of hypoosmotic stress.

 

Ключевые слова: Глутатион, апоптоз, тимоцит, гипоосмотик.

Keywords: Glutathione, apoptosis, thymocyt, hypoosmotic.

 

Глутатион (GSH) – это трипептид (γ-глутамилцистеилглицин), который является основным свободным тиолом и низкомолекулярным антиоксидантом в большинстве живых клеток. Внутриклеточный глутатион участвует во многих биологических процессах, таких как восстановление ксенобиотиков, устранение гидропероксидаз и поддерживает восстановленное состояние белковых сульфогидрильных групп в цитозоле. Концентрация внутриклеточного глутатиона в большинстве типов клеток составляет около 1- 2 мМ. Небольшое количество глутатиона может находиться также и в межклеточной среде. В интерстициальной жидкости концентрация глутатиона оставляет несколько мкМ, а в плазме эта величина обычно вдвое выше. Хотя роль внутриклеточного глутатиона в поддержании иммунного статуса организма хорошо известна, роль внеклеточного глутатиона и пути его выхода из лимфоидных клеток практически не изучены.

Лимфопоэтические клетки-предшественники зарождаются в костном мозге, откуда вместе с кровотоком они поступают в тимус. Здесь они пролиферируют и подвергаются процессу позитивной и негативной селекции. Большая часть погибает путем апоптоза, и только зрелые клетки, имеющие на своей поверхности Т-рецептор, но не реагирующие на собственные антигены, выходят в кровоток в качестве зрелых Т-лимфоцитов [7]. В настоящее время известно, что как пролиферация, так и апоптоз требуют наличия эффективной системы регуляции клеточного объёма, который претерпевает значительные изменения при этих процессах. Ранее было показано, что лимфоциты тимуса обладают эффективной системой регуляторного уменьшения объема в условиях гипоосмотического стресса [1,4,5,6,7,9,10]. Является ли осмотический стресс сигналом для выброса глутатиона из тимоцитов? В настоящей работе мы впервые продемонстрировали, что при осмотическом набухании тимоцитов происходит массовый выброс глутатиона во внеклеточную среду.

В наших экспериментах, нормальный раствор Рингера содержал (мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 глюкозы, pН 7,4 (290±2 мОсм/кг Н2О). Гипотонические растворы различной осмоляльности (от 40 до 290 мОсм/кг Н2О) готовились путем разведения нормального раствора Рингера в различных соотношениях буфером следующего состава (мМ): 5 KCl, 10 HEPES, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 глюкозы, pН 7,4 (40±2 мОсм/кг H2O). Опыты проводили на 6-8 недельных белых крысах линии Вистар. Выделение тимоцитов проводили по стандартной методике как описано ранее [4,6,7] и их жизнеспособность определяли по исключению трипанового синего. Конечную суспензию, содержащую не более 5% погибших клеток, хранили в растворе Рингера и использовали в течение 3-5 ч.

Количественное колориметрическое определение глутатиона проводили по методу, основанному на окислении GSH до дисульфида GSSG при взаимодействии с реагентом 5,5′-дитиобис 2-нитробензойной кислотой (5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoic acid, DTNB), который, в свою очередь, восстанавливается до 5-тио-2-нитробензойной кислоты (5-thio-2-nitrobenzoic acid, TNB). Продукт реакции (TNB) имеет жёлтую окраску и определяется фотометрически при λ 412 нм [2]. В присутствии глутатионредуктазы и НАДФН происходит непрерывная рециклизация GSSG, который при этом восстанавливается до исходного GSH. Поэтому, в комбинированной реакции глутатион играет роль катализатора в общей реакции восстановления DTNB до TNB за счет НАДФН, скорость которой прямо пропорциональна концентрации глутатиона в микромолярном диапазоне.

В наших экспериментах мы зарегистрировали заметные количества глутатиона во внеклеточной среде даже в отсутствии стимуляции при инкубации тимоцитов в нормальных изоосмотических условиях. Базовый выход глутатиона составил 0,29 ± 0,07 мкМ при концентрации клеток в суспензии, равной 12,5 млн/мл и 1,11 ± 0,04 мкМ в суспензии, содержащей 100 млн/мл клеток после 10-мин инкубации. В условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг H2O) мы наблюдали резкое увеличение скорости выхода глутатиона, которая составила 1,23 ± 0,09 мкМ и 6,37 ± 0,04 мкМ в суспензии с концентрацией клеток 12,5 млн/мл и 100 млн/мл после 10-мин инкубации, соответственно. Зависимость содержания глутатиона во внеклеточной среде от числа клеток в суспензии была близка к линейной как при нормальных изотонических условиях, так и в условиях гипоосмотического стресса, как это показано на рисунке 1А. Это является доказательством того, что именно тимоциты являются источником глутатиона во внеклеточной среде в наших экспериментальных условиях.

Кинетика выхода глутатиона заметно отличалась в изотонических и гипотонических условиях. Так, если базовый выход глутатиона в нормальных условиях плавно увеличивался во времени, то при гипоосмотическом стрессе мы наблюдали, резкое скачкообразное увеличение содержания глутатиона в среде в начальный момент времени, которое затем сменялось плавным ростом до примерно постоянного уровня, которое достигалось после 20-минутной инкубации (рис. 1Б).  

Рисунок 1. Выход глутатиона в нормальной изотонической среде

(светлые символы) и в условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг Н2О; тёмные символы) в зависимости от концентрации клеток в суспензии (А: время инкубации 10 мин) и времени (Б: концентрация клеток 100 млн/мл). Эксперименты проведены при 25оС. Во всех случаях Р < 0,05 относительно нормы (контроль)

 

Такая двухфазная кинетика, по-видимому, может свидетельствовать о наличии, по крайней мере, двух механизмов выхода глутатиона из тимоцитов с различными кинетическими параметрами.

Изложенные выше результаты, свидетельствуют о массовом выбросе глутатиона из тимоцитов во внеклеточную среду как в нормальных условиях, так и при гипоосмотическом стрессе. Присутствует ли аналогичная система регулируемого выброса глутатиона в других типах клеток? Для ответа на этот вопрос мы исследовали выход глутатиона из нормальных человеческих эритроцитов после 20 минутной инкубации в среде с различной тоничностью при варьировании числа клеток в суспензии. Было установлено, что концентрация глутатиона во внеклеточной среде в суспензии эритроцитов с концентрацией 100 млн/мл составляет 0.57±0.14 мкМ (n=5) при изотонических условиях и 1,33±0.11 мкМ (n=5) в гипоосмотической среде. Концентрация внеклеточного глутатиона росла линейно с ростом числа клеток в суспензии в диапазоне от 100 млн/мл до 1 млрд/мл (Рис. 2).  

Рисунок 2. Выход глутатиона из красных кровяных клеток человека в нормальном состоянии
(290 мОсм/кг Н2О) и в условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг Н2О)

 

В расчете на одну клетку, скорость выхода глутатиона из эритроцитов составила в нормальной среде 0,09х10–15 г/мин, а и при гипоосмотическом стрессе 0,2х10–15 г/мин. Для сравнения этих величин со скоростью выброса глутатиона из тимоцитов мы пересчитали данные, приведенные на рисунке 1, в расчете на одну клетку. Анализ данных показал, что скорость выхода глутатиона из тимоцитов составляет 0,34х10–15 г/мин и 1,96х10–15 г/мин в нормальных и гипоосмотических условиях, соответственно. Сравнение этих величин с данными для эритроцитов показывает, что скорость выброса глутатиона из красных кровяных клетках примерно в 4 раза медленнее, чем из тимоцитов в нормальной среде и практически в 10 раз медленнее в условиях гипоосмотического стресса. Хотя скорость выброса глутатиона из эритроцитов оказалась достаточно низкой по сравнению с тимоцитами, однако, учитывая то, что эритроциты составляют основную массу форменных элементов крови, этой скорости, по-видимому, вполне достаточно для того, чтобы обеспечить физиологический уровень глутатиона в плазме. Высокая скорость выхода глутатиона из тимоцитов может свидетельствовать о важной роли этой молекулы в физиологических процессах, протекающих во внеклеточной среде тимуса.

На следующем этапе экспериментов мы исследовали выход глутатиона из раковых клеток меланомы в культуре (линия КМЛ). Клетки выращивались в стеклянных карелях при температуре 370С до конфлуэнтного состояния (т.е. до формирования клеточного монослоя). В этих экспериментах концентрация внеклеточного глутатиона монотонно росла во времени (Рис. 3) и после 40 минут инкубации составила 0,66±0,06 мкМ (n=5) в нормальных условиях и 1,26 ± 0,012 мкМ (n=5) при гипоосмотическом стрессе. Полученные результаты показывают наличие механизма выхода глутатиона в раковых клетках меланомы и о его возможной роли в процессе канцерогенеза.  

Рисунок 3. Выход глутатиона из культуры раковых клеток меланомы в нормальном состоянии
 (290 мОсм/кг Н2О) и в условиях гипоосмотического стресса (147 мОсм/кг Н2О). Звёздочки означают статистически значимое отличие от контроля на уровне Р<0.05

 

Список литературы:
1. Arrazola, A., Rota, R., Hannaert, P., Soler, A., Garay, R. P. Cell volume regulation in rat thymocytes // J. Physiol. 1993. Vol.465. P. 403-414.
2. Eyer, P.,Podhradsky, D. Evaluation of the micromethod for determination of glutathione using enzymatic cycling and Ellman's reagent // Anal. Biochem. 1986. Vol.153. P. 57-66.
3. Forman, H. J., Zhang, H., Rinna, A. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis // Mol. Aspects Med. 2009. Vol.30. P. 1-12.
4. Курбанназарова Р.Ш., Азимов Р.Р., Ташмухамедов Б.А., Сабиров Р.З. Водная проницаемость лимфоцитов из тимуса крыс: участие водных каналов и пуринэргическая модуляция. 2002.53-56 с.
5. Kurbannazarova, R. S., Tashmukhamedov, B. A., Sabirov, R. Z. Osmotic water permeability and regulatory volume decrease of rat thymocytes // Gen. Physiol Biophys. 2003. Vol.22. P. 221-232.
6. Kurbannazarova, R. S., Tashmukhamedov, B. A., Sabirov, R. Z. Role of potassium and chlorine channels in the regulation of thymocyte volume in rats // Bull. Exp. Biol. Med. 2008. Vol.145. P. 606-609.
7. Меланова Н.Р. Исследование системы выброса глутатиона из клеток // Автореф. дисс.….PhD по биологическим наукам. – Ташкент, 2018. – 48 с.
8. Savino, W., Dardenne, M. Neuroendocrine control of thymus physiology // Endocr. Rev. 2000. Vol.21. P. 412-443.
9. Sabirov, R. Z., Manjosova, M. A., Tadjibaeva, E. T., Krasilnikov, O. V. The interaction of amphotericin B with cell membrane of rat thymocytes // Gen. Physiol Biophys. 1993. Vol.12. P. 249-257.
10. Soler, A., Rota, R., Hannaert, P., Cragoe, E. J., Jr., Garay, R. P. Volume-dependent K+ and Cl- fluxes in rat thymocytes // J. Physiol. 1993. Vol.465. P. 387-401.

 

Информация об авторах:

Меланова Назира Рашидовна Nazira Melanova

доктор философии (PhD) по биологическим наукам, преподаватель Наманганского инженерно- технологического института, Узбекистан, г. Наманган

PhD in biological sciences, teacher, Namangan Institute of Engineering and Technology, Uzbekistan, Namangan region, Uzbekistan, Namangan


Журнал зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор), регистрационный номер ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013
Учредитель журнала - ООО «МЦНО»
Главный редактор - Ларионов Максим Викторович

Читателям

Информация о журнале

Выходит с 2013 года

ISSN: 2311-5459

Св-во о регистрации СМИ: 

ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013

Скачать информационное письмо

Включен в перечень ВАК Республики Узбекистан

Размещается в:

doi:

The agreement with the Russian SCI:

cyberleninka

google scholar

Ulrich's Periodicals Directory

socionet

Base

ROAR

OpenAire