Висмут-модифицированные электроды в вольтамперометрическом анализе органических соединений и биологически активных веществ: опыт применения и перспективы развития

Поиск путей замены токсичной ртути в вольтамперометрическом методе анализа к началу 2000-х годов привел созданию висмут-модифици­рованных электродов [38]. С тех пор такие, экологически чистые электроды приобретают все большую популярность. Эти электродные материалы в большей степени отвечают «зеленым» принципам химии. В самом деле, в большинстве случаев висмутовые электроды имеют аналогичные электроаналитические характеристики, что и ртуть (за исключением, более ограниченного диапазона анодной поляризации), обладая при этом почти в 5000 раз меньшей токсичностью, чем ртуть и ее соли. Немаловажно и то, что при комнатной температуре висмут, в отличие от ртути, имеет агрегатное состояние твердого тела, что также позволяет бȯльшие возможности в придании определенных геометрических форм при изготовлении сенсоров.

Область электроанализа с использованием висмутовых электродов рассматривалась ранее в многочисленных обзорах и диссертационных работах [13,22,35,39,45,46]. Однако, несмотря на тот факт, что висмут является привлекательным элект­родным материалом для определения органических соединений, из-за высоких потенциалов перенапряжения в катодной области потенциалов, большой применимости в вольтамперометрическом анализе органических и биологически активных соединений не нашел.

Настоящий обзор нацелен на изучении анали­тических возможностей и вариантов применения висмут-содержащих электродов в вольтамперометрическом определении ряда органических и биологически активных веществ. В обзоре рассматриваются висмутовые электроды различных типов (металлические висмутовые, композиционные, поверхностно или объемно модифицированные пленкой и наночастицами висмута), а также различные классы органических соединений, способных быть проанализированными электрохимическими методами с использованием таких рабочих электродов (пестициды, нитро- и азо-соединения, биологически активные вещества).

Типы висмутовых электродов для органического электроанализа

Простейшим висмутовым электродом для органического электроанализа является висмут-объемный электрод. Его изготавливают из висмутового стержня, встроенного в изолятор [31], или путем формования расплавленного висмута в цилиндрической стеклянной трубке с образованием стержня [7,14]. Преимуществами этого типа датчиков являются простота изготовления, легкая и быстрая регенерация поверхности (путем простой полировки) и относительная однородность поверхности электрода.

Висмут-пленочные электроды обычно изготавливаются путем гальванического покрытия способом in situ или ex situ тонкой висмутовой пленкой на поверхности токопроводящей подложки. Так, в работе [44] описана процедура изготовления электрода, которую мы приводим ниже. Из электродов для спектрального анализа марки СУ-3 делали заготовки длиной 70 мм и диаметром 6 мм. Торцы заготовки электродов выравнивали с помощью наждачной бумаги. С одного из концов высверливали лунку глубиной 3- 5 мм. Заготовку вставляли в термоусадочную трубку ISKE2-(3X)G:6.4/2.1 с клеевым слоем (коэффициент усадки 3:1) таким образом, чтобы с противоположного от лунки конца оставалось 10 – 15 мм, для подключения контактов электролитической ячейки. После термоусадки пленка подрезалась по краю торца с лункой. Лунку электрода покрывали электроли­тическим способом тонким слоем меди при плотности тока ~ 10 мА/см² в течение 10 минут. Затем электроды высушивали при комнатной температуре в течение 8-10 часов. Процедура нанесения слоя электролитически осажденной меди благоприятствует сцеплению углеродсодержащей пасты с угольной заготовкой.

Углеродсодержащую пасту готовили смешением тонкодисперсного порошка из углеграфита СУ-3 с расплавленным парафином в соотношении 50:50 мас. / %. Расплавленная углеродсодержащая масса с помощью стеклянной или деревянной палочки заливалась в лунку заготовки электрода, закрепленного вертикально. Электрод оставляли на 1-2 суток для полного застывания пасты и схватывания ее с поверхностью углеграфитового стержня. Затем слой, выступающий за пределы термоусадочной трубки, удалялся шлифовкой на наждачной бумаге «нулевка» и поверхность полировали на фильтровальной бумаге и стеклянной пластине. Электрод с отполированной до зеркального блеска поверхностью подвергали модификации, созданием на его поверхности пленки висмута гальваническим методом in situ или ex situ.

Практика показывает, что гальваническое покрытие in situ подходит только для анализа следов металлов с помощью анодной вольтамперометрии, которая включает стадию предварительного электролиза аналита на катоде. Покрытие рабочего электрода, обычно индифферентного, висмутовой пленкой осуществляют электролизом Bi(III)-содержащих солей из кислых растворов с целью предотвратить нежелательный гидролиз солей.

Условия нанесения покрытия являются переменными: концентрация Bi (III) в растворе для нанесения покрытия варьируется от нескольких мг/л [20] до нескольких г/л [43]. Наиболее часто используется электролиз висмутовых солей с содержанием Bi (III) от 50 до 500 мг/л [5,24,33]. В качестве электролита обычно применяют минеральные неокисляющие кислоты [14,15] или кислотный буферный раствор [2,5,34].

Иногда в фоновый электролит добавляют соли галогенидов щелочных металлов, улучшающих электропроводность раствора. В работах [17,18] было показано, что присутствие KBr в фоновом электролите способно улучшить адгезию висмутовой пленки к поверхности электрода.

Потенциал осаждения висмута обычно меньше –0,6 В относительно насыщенного хлорид сереб­ряного электрода [10,11,15]. Время нанесения висмутовой пленки на поверхность электрода обычно варьируется от 60 секунд [17,20] до нескольких минут [12,29].

В качестве подложек для образования висмутовой пленки использовались различные мате­риалы: медь [15,16,23], твердые серебряные амальгамы [12], стеклоуглерод [4,6,8,9,17,18,19,29,30,33,34,38,41], мезопористые платиновые микроэлектроды [10,11], углеродная паста [7,14,19,25,29], свинец [5,42] и планарные микроэлектроды, изготовленные методом трафа­ретной печати с использованием углеродсодержащих чернил [28].

В ряде работ также сообщалось о применении в анализе органических соединений проточных электрохимических ячеек с модифицированным висмутовой пленкой стекоуглеродным или пастовым угольным электродом [20,32,43]. В этом случае этапы получения висмутовой пленки и зачистки индикаторного электрода проводились в режиме онлайн. Для этого раствор Bi (III) поступал в ячейку с рабочим электродом, к которому прикладывали отрицательный потенциал для получения пленки висмута на его поверхности. Пленку также потенциостатически очищали при анодном потенциале в проточном растворе [20,32]. Преимущества пленочного висмутового электрода заключаются в возможности эффективной регенерации поверхности электрода путем удаления использованной пленки. Однако, было отмечено, что однородность поверхности электрода довольно изменчива и зависит от условий нанесения покрытия.

В работах [1,3,28,36] сообщается также об использовании электродов на основе висмута, модифицированных специфичными биомолекулами (ферментами, антигенами). Для таких биосенсорных устройств висмутовая пленка является субстратом. При этом модификация сенсора может варьироваться от простого нанесения на поверхность электрода наночастиц висмута и фермента, до иммобилизации фермента в полимерной матрице на висмут-модифицированный электрод, и, наконец, захвата ферментов во время осаждения висмута in situ.

В большинстве аналитических приложений, связанных с определением токсичных органических соединений и лекарственных средств в фазе раствора, основанных на применении висмутовых или Bi-модифицированных электродов, в качестве метода обнаружения использовалась циклическая вольтамперометрия [10,11,17,20,31] или вольтамперомерометрия с линейной разверткой потенциалов [12]. Тем не менее, импульсным вольтамперометрическим методам, с точки зрения возможности достижения низких пределов обнару­жения, обусловленных минимизацией нефарадеевских составляющих тока, следует отдать бȯльшое предпочтение. Так, в работах [5,6,8,9,12,14,15,18,19,33,40] описано успешное использование дифференциально-импульсной вольт­амперометрии в определении органических соединений. Высокая чувствительность определения достигается при использовании дифференциальной импульсной вольтамперометрии с квадратно-волновой разверткой потенциалов [4,20,21,29,30].

Еще более низкие пределы обнаружения могут быть достигнуты с использованием инверсионной вольтамперометрии. В этом случае вольт­амперометрическому сканированию предшествует этап предварительной концентрации аналита на рабочем электроде. Здесь уместно упомянуть, что органические вещества способны адсорбироваться на поверхности индикаторного электрода, что позволяет в большинстве случаев использовать адсорбцию в качестве высокоэффективного этапа предварительного концентрирования. Однако, как показывает эксперимент, этот феномен желательно использовать в сочетании с катодным сканированием потенциалов, позволяющим уменьшить количество накопленных частиц, а, следовательно, и время предварительного электролиза [7,14,16,25,34,42]. Вольтамперометрия адсорбционного концентрирования с анодной разверткой потенциалов несколько ограничена [23,26,41], что связано с отрицательным проявлением адсорбционных эффектов в формировании профиля вольтамперограммы.

Биосенсоры по своей природе избирательны благодаря включению биологически активного агента (фермента или антигена), высокоспеци­фичного для целевого определения вещества в составе аналита. В этом случае дифференциальная вольтамперометрия [1] и хроноамперометрия являются более простыми методами обнаружения медиаторов или продуктов ферментативных реакций [3,14,27,28,36,43]. В работах [20,32] описываются проточные методы определения органических веществ с амперометрической детекцией.

Обзор аналитического приложения Bi-модифицированных электродов

Определение токсичных органических соединений

В большинстве случаев Bi-модифицированные электроды в органическом электроанализе предназна­чаются для определения токсичных веществ и лекарственных препаратов.

Они могут быть обнаружены методом фазовой вольтамперометрии с линейной, дифференциальной или дифференциально-импульсной с квадратно-волновой разверткой потенциалов.

Объектом исследования поведения Вi-модифицированных электродов служили различные ароматические нитропроизводные, сравнительно легко поддающиеся прямому катодному вольтамперо­метрическому определению. Пленочный висмут-модифицированный электрод использовался для определения мононитрофенолов, динитрофенолов, нитробензойной кислоты и нитробензальдегида [14,31]. Нитрофенолы также были проанализированы проточным методом в электрохимической ячейке, снабженной стеклоугле­родным рабочим электродом, предварительно покрытым пленкой висмута [20]. 2,4-динитрофенол в образцах воды методом добавок определяли на подложке из стеклоуглерода, покрытой ex situ пленкой висмута [33]. 2 – Амино – 6 – нитробензотиазол был определен в питьевой водопроводной воде и минеральной воде с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии на серебряно-ртутном амальгамном электроде, покрытом ex situ пленкой висмута [12]. 2-нитрофенол и 4-нитрофенол были обнаружены с использованием хемометрического подхода [5] на свинцовом электроде (pencil-lead electrode), покрытым висмутовой пленкой [5]. Наконец, нитробензол в присутствии цетилтриметил-аммонийбромида был обнаружен в пробах воды методом добавок с использованием угольного пастового электрода, с заранее осажденной на него пленкой висмута [25].

Такие пестициды, как паракват и атразин были обнаружены в образцах воды на медном электроде, покрытым висмутовой пленкой [15,16]. А на модифицированном висмутовой пленкой стекло­углеродном электроде были идентифицированы различные другие пестициды и гербициды: (тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, нитенпирам, метамитрон, клотианидин, тиаметоксам) [17,18,19,29].

Для определения гербицидов и инсектицидов были использованы электроды из углеродной пасты, модифицированные пленкой висмута [4,19,29]. Азокрасители были определены в напитках на стеклоуглеродном электроде, покрытом пленкой висмута [9] или предварительно модифицированном поли-аминобензолсульфоновой кислотой, перед покрытием пленкой висмута [40].

Определение фармацевтических препаратов и лекарств

Витамины B₁₂, В₂, С были определены методом анодной инверсионной вольтамперометрии с использованием Bi-модифицированного медного электрода [23].

Витамин В₁₂ предварительно концентрировали в виде Со (II) на электроде с последующим повторным окислением Со (II) до Со (III) с при анодном сканировании. Метод использовался для определения витамина В₁₂ в фармацевтических препаратах.

Такие сульфо-препараты, как силденафил, колхицин, аминосалицилаты и сульфатиазин, а также фолиевая кислота были определены в фармацевтических препаратах на Вi-модифицированных стеклоуглеродных электродах [6,8,30,34,37].

Проточная ячейка с трубчатым углеродным электродом, покрытым пленкой висмута в режиме ex-situ, использовалась для амперометрического определения диклофенака в фармакологических продуктах [32]. Дауномицин, применяемый в химиотерапии онкозаболеваний, определяли методом адсорбционной вольтамперометрии с квадратно-волной разверткой потенциалов с использованием пастового висмут-модифицированного электрода [7].

Наконец, для определения цилостазола (препарат для лечения перемежающейся хромоты и профилактики инсульта) в фармацевтических препаратах и  плазме крови человека с помощью анодной квадратно-волновой был использован стеклоуглеродный электрод, модифицированный углеродными нанотрубками и висмутом [21].

Определение биологически значимых органических соединений

Ряд биологически активных веществ также может быть определен с использованием адсорбционной дифференциально-импулсной вольтамперометрии. Так, абсцизиновую кислоту, относящуюся к фитогормонам, определяли методом адсорбционной инверсионной вольтамперометрии с квадратно-волновой разверткой на покрытом висмутом свинцовом электроде (pencil-lead electrode) [42].

Металлопротеины (группа белков, которые содержат атомы металлов и играют важную биологическую роль в метаболизме и детоксикации некоторых тяжелых токсичных металлов, таких как Zn, Cd, Cu, Hg), могут быть косвенно определены с помощью анодной инверсионной вольтамперо­метрии путем измерения содержания катионов металлов, сконцентрированных в составе металлопротеинов на Bi- модифицированном стеклоуглероде [41]. Проточная ячейка с использованием висмут-содержащего электрода, предварительно приготовленного на подложке из стеклоуглерода, использовали для определения Escherichia coli с помощью проточно-инжекционного анализа. Метод основывался на выделении β-D-глюкуронидазы из бактериальных клеток в культуральной среде, которая катализировала гидролиз субстрата 4-нитрофенил-β-D-глюкуронида с образованием 4-нитрофенола; культуральную среду, содержащую образующийся 4-нитрофенол, вводили в коллектор проточно-инжекционного анализатора, а 4-нитрофенол определяли амперометрически на пленочном висмутовом электроде [43].

Путем иммобилизации α-глюкозидазы в желатине на покрытом висмутом стеклоуглеродном электроде были сконструированы биосенсоры ингибиторов фермента (амарил и акорбоза), имеющих большое значение при изучении и диагностики инсулинзависимого сахарного диабета [36]. Здесь, в качестве ферментативного субстрата использовали 4-нитрофенил-D-глюкопиранозид, а высвобожденный 4-нитрофенол измеряли с помощью хроноамперометрии. Тот же принцип дизайна был использован для создания биосенсора глюкозы для анализа вин путем иммобилизации глюкозооксидазы на предварительно приготовленный Bi-пленочный стеклоуглеродный электрод [3].

Таким образом, для биораспознавания биологически-активных веществ дизайн Bi-модифицированных электродов должен предусматривать введение в него ферментов или антител [1,2]. С этой целью был разработан алгоритм модификации сенсора биологическими агентами. Согласно этого алгоритма, раствор в электролитической ячейке помимо ионов Bi (III), содержал элемент биологического распознавания. Во время восстановления Bi (III) биологический агент захватывался внутри или оседал на поверхности электрода. Этот модифицирующий подход был применен в определении ксантина в напитках с использованием ксантиноксидазы и хроноамперометрического определения кислорода, являющимся в этом случае медиатором [2].

Для изучения иммуновзаимодействия IgE и анти-IgE в качестве индикатора реакции использовали вольтамперометрическую индикацию электрохими­ческого окисления нейтрального красного [1].

Аналогичным образом screen-printed электроды, изготовленные методом трафаретной печати, и модифицированные пленкой висмута и грибной тканью, были применены для обнаружения фенола [28]. В этом случае хроноамперометрический отклик был получен при рабочем потенциале +800 мВ. Обычно такой положительный потенциал может вызвать окисление и удаление пленки висмута, но в этом случае этого не наблюдалось, что авторы объяснили образованием стабильного комплекса между Bi-пленкой и грибковой тканью. Практическим выводом этого исследования стало то, что полифенолоксидаза была активным ферментом в этом биосенсоре.

Биосенсор, специфичный для фенолов, был изготовлен путем нанесения распылением на электрод с трафаретной печатью наночастиц висмута и тирозиназы, катализирующей окисление фенолов в о-хинон. Образующийся о-хинон детектировался амперометрически по его восстановлению на поверхности электрода до катехина [27].

На мезопористом Pt-электроде, модифицированном пленкой висмута, удалось определить глюкозу путем ее окисления до глюконовой кислоты [10]. Кроме того, электрод из многостенных углеродных нанотрубок, модифицированный порошком висмута, был использован для диагностики Helicobacter pylori с помощью адсорбционной вольтамперометрии (в сочетании с анодным сканированием) [26].

Наконец, определение муравьиной кислоты (в данном случае действующей в качестве ингредиента в топливных элементах) было выполнено циклической вольтамперометрией с на мезопористом Pt-электроде, модифицированного пленкой висмута [11].

Заключение

Проведенный экскурс показывает, что Bi-модифи­цированные электроды могут успешно использоваться для анализа органических соединений. Пределы обнаружения токсичных нитроорганических соединений и пестицидов на висмутовых электродах вполне удовлетворительны и достигают предела обнаружения ниже 1 мкмоль/л. Однако, при этом не всегда достигается необходимая селективность вольтамперометрического определения в пробах со сложной матрицей, что ограничивает их применение в анализе биологических объектов и пробах окружающей среды. Поэтому такие датчики, скорее всего, будут полезны для целей скрининга.

Наоборот, азокрасители и некоторые пестициды, имеющие в своем строении азо-сочетанную группи­ровку, эффективно обнаруживаются в разнообразных образцах пищевых продуктов и фармацевтических препаратов вольтамперометрическим методом с использованием висмутовых электродов.

Наконец, электроды на основе висмута в сочетании с биоразпознающими веществами могут быть использованы в качестве биосенсоров для определения биологически важных маркеров в клинических образцах, продуктах питания и объектах окружающей среды, поскольку необхо­димая селективность обеспечивается биоспеци­фичным взаимодействием. Именно здесь следует ожидать наибольший поток исследований, использующих различные варианты вольтамперометрического анализа с экологически чистыми Bi-модифици­рованными электродами с применением проточно-инжекционной и он-лайн техники измерения.