Международный
научный журнал

Стимулирующий эффект препарата эмистима С при прорастании гороха (Pisum sativum L.) на разных фазах клеточного цикла


Determination of activity effect of emistim C on thedifferent fases of germination of sead of Pisum sativum L

Цитировать:
Рассоха С.Н. Стимулирующий эффект препарата эмистима С при прорастании гороха (Pisum sativum L.) на разных фазах клеточного цикла // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2018. № 7(49). URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/6104 (дата обращения: 21.11.2019).
 
Прочитать статью:


АННОТАЦИЯ

В лабораторных условиях изучали чувствительность генома проростков гороха сорта Рапорт к препарату эмистиму С. На каждой из фаз деления клеточного цикла проявлялся стимулирующий эффект этого биологически активного препарата, который изображался на графиках в виде кривых доза эффект и подчинялся правилу Арндта-Шульца. Возрастание митотического индекса в корнях гороха, обработанных малыми дозами эмистима С является показателем действия препарата на геном клеток корней прорастающего семени гороха в состоянии активного клеточного деления.

ABSTRACT

It was carried out investigations genome sensitivity of peas seedlings sort Rapport to biostimulin Emistim C. All fases of cell cycles were sensitive to physiological-active substances which composed Emistim C. The action of this influence to confirm the law of Arndt-Schultz and revealed the periodical fallings and upwards of activity peaks (doza-effekt rule).

 

Ключевые слова: клеточный цикл, фазы деления, митотический индекс (МИ), тест-объект, эмистим С, стимуляция, доза-эффект.

Keywords: cell cycle, the fases of distribution, the mitotic index (MI), test-object, Emistim C, stimulation, doza-effect.

 

Введение:

Гормональная система растений влияет на все аспекты роста и развития растений. Понимание, как работает эта система, дает возможность побороть многие неблагоприятные факторы, которые ограничивают естественные циклы роста растений и генетическую экспрессию. Растительные гормоны присутствуют на разных стадиях жизненного цикла растений. Они могут быть доступны в достаточном количестве в течение всего жизненного цикла растения для максимизации генетической экспрессии. Растительные гормоны должны постоянно производиться и регулироваться клетками кончиков корней в достаточном количестве, чтобы поддерживать жизненные процессы и оптимизацию гормонального баланса.

Гормональные уровни растения изменяются в зависимости от биотических или абиотических факторов внешней среды в двух направлениях:

Во-первых, сигнальная система растения, которая находится в верхней части корневой системы, контролирует изменения во внешней среде, регулирует изменения уровня гормонов во всех тканях растения;

Во-вторых, энзимы, производящие гормоны, имеют определенную температуру работы. Гормоны не могут эффективно производиться при очень высокой или очень низкой температурах (Рис.1).

Гормональный дисбаланс может вызвать любая стрессовая ситуация:

Абиотический стресс: жесткие погодные условия, высокий уровень азота, соленость, токсичность и уплотненность почв, и т.д.

Биотический стресс: заболевания, вредители, сорняки, гербициды, загрязненность почв тяжелыми металлами и т.д.

 

Превышающие факторы среды (избыток)

-----------------------------------------------------------------------------------------------

Температура вода свет ветер нитраты питание

(NO3)

t ≥ 320 C ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

 ----------------------------------------------------------------------------------------------

ОПТИМАЛЬНАЯ ЗОНА РОСТА (200- 320 C)

-----------------------------------------------------------------------------------------------

t ≤ 200 C ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (NO3) ↓

температура вода свет ветер нитраты питание

-----------------------------------------------------------------------------------------------

Понижающие факторы среды (недостаток)

Рисунок 1. Диапазон температур, при которых оптимально производятся фитогормоны

 

При стрессе обычно происходит следующее: разрушаются или изменяют свою пропускную способность мембраны; происходит увеличение повреждений окисляющих агентов; снижение необходимой нормы функции протеинов. На уровень растительных гормонов влияют также питательные вещества, как катализаторы гормонального синтеза, так и восприятия. Способность корней поглощать питательные вещества из почвы зависит от рН почвы и наличия хелатирующих агентов. Антиоксиданты снижают уровень радикалов кислорода для защиты клеточных мембран, энзимов, ДНК, снижая повреждения клеток и стресс. Комплекс полиаминов стабилизирует клеточную структуру, увеличивает доступность и эффективность питательных веществ. N-HIB –технологии увеличивают количество энергосберегающего нитрата амина (NH2). Эта технология [14, 15] позволяет преобразовывать мочевину в аминную форму азота, ингибируя активность энзимов «уреаза». Растение минует фазу преобразования нитратной формы азота в аминную, что позволяет растению сохранять сахар в плодах. Эта техника способствует поднятию на 50% нижнего уровня использования мочевины из-за сокращения потерь азота при вымывании и испарении; конт­ролировать вегетативный рост при дополнительном использовании энзимами «редуктазы нитратов» с преобразованием неиспользуемого NH3 в используемый аминный азот NH2 . Увеличить доступность сахара в растении для роста плодов, сухого вещества, специальной тяжести, показаний Брикс. Эти процессы происходят из-за увеличения энергии фотосинтеза, доступной для производства сахара и синтеза аминокислот, что увеличивает его поток из листьев в плоды.

Учитывая эти факторы и предварительные имеющиеся данные по изучению механизма действия биологически активных веществ – регуляторов роста растений, мы на примере препарата эмистима С, изучили его действие в широком спектре концентраций разведений на разных фазах клеточного цикла на примере корешков проростков гороха.

Цель исследования:

Раннее было показано [11], что динамика изме­нения структурного и функционального состояний генома имеет сортовую и видовую специфику, чем может быть обусловлена необходимость разной продолжительности обработки семян для получения стимулирующего эффекта. Авторы считают [1, 2, 3, 13, 14], что важная роль в модели клеточного цикла принадлежит тому, чтобы выяснить механизм действия фитогормональных соединений и физиологически активных рострегулирующих веществ, которые являются мощным фактором увеличения продук­тивности сельскохозяйственных культур. В нашей работе на примере корешков проростков гороха (сорт Рапорт) показана активность действия эмистима С на разных фазах прорастания. Известно временное распределение фаз клеточного цикла [10-12, 13, 15] по схеме, которая позволяет откалибровать проросшие семена по фазам клеточного цикла:

 Сухое семя → G0 → G1 → S → G2 → Митоз

 0 ч. 3-6ч. 16-19ч. 28-31ч. 33-36 ч. 38-41ч.

 

Методика проведения опытов:

Клетки прорастающих семян гороха высоко­чувствительны в период активации хроматина и максимально восприимчивы к влиянию физиологически активных веществ (Троян В.М., 1998) [7, 9]. Клетки зародышей были использованы нами для подбора эффективных концентраций ФАВ – в частности к эмистиму С. В работе соблюдали следующие экспериментальные условия:

1. Семена замачивали в постоянном объеме воды до половины высоты семени при постоянной температуре 240 С.

2. Для равномерного прорастания отбиралась фракция однородно набухших семян через три-четыре часа после инкубации в воде.

3. Для отбора клеток в период выхода из сос­тояния покоя использовались полностью набухшие семена без признака роста зародыша.

4. Для отбора клеток в G0–фазе использовались семена с признаками видимого роста зародыша, но до проклевывания, а для отбора клеток, вступающих в G1–фазу – семена в момент проклевывания.

5. Для получения максимального количества клеток в S–фазе длина проклюнувшегося корешка должна быть в пределах 0,5 – 0,8 см, а в митозе –
1,2 – 1,5 см.

Выполняя данные условия, можно получить определенное количество клеток с уровнем синхронности не ниже уровня живых систем клеток на протяжении пререпликативного периода и в S–фазе цикла, что позволяет смоделировать схему проверки активности действия эмистима С в период фаз клеточного цикла.

В эксперименте проводили обработку в течение трех часов в растворах эмистима С в концентрациях растворов от 10-4 до 10-9 М на тех этапах прорастания гороха, которые соответствовали определенным фазам цикла в меристеме.

Для G0–фазы семена, предварительно замо­ченные в воде на три часа, обработали в течение трех часов последовательными концентрациями (от

10-4 до 10-9М) эмистима С, промывали водой и инкубировали в термостате 5-6 дней при температуре 240 С.

Для G1–фазы семена гороха замачивали на 16-19 часов, затем 3 часа обрабатывали эмистимом С, промывали водой и выращивали на влажных фильтрах в течение 5-6 дней при температуре 240 С.

Для S–фазы замачивали семена на 28 часов с последующей обработкой семян эмистимом С в течение трех часов, промывали водой и оставляли на влажных фильтрах на 5-6 дней при той же температуре.

Так же поступали с семенами при митозах, но замачивали их на 38-41 час.

Учет опытных образцов гороха проводили, срав­нивая с контрольными по общей массе корешков, гипокотилей и средней массе одного корешка и одного гипокотиля. Стимуляцию вычисляли в процентах.

Нами были исследованы тип и спектр физиологической активности препарата эмистима С, которая отображалась на графиках, как неравномерная кривая спадов и подъемов активности в зависимости от разведений препарата эмистима С на проростки гороха посевного PisumsativumL. на разных стадиях прорастания. Имея 2-3 и более подъемов активности на графиках, можно говорить о наличии доза-эффект [2, 3]: стимуляции препаратом в нескольких концентрациях. Нами были использованы методики подсчетов биотестов и митотических индексов [4, 5, 8].

Результаты исследований и обсуждение:

Готовили препараты, фиксированные и окрашенные по общепринятой методике Паушевой для подсчета митотических индексов [8]. На графическом рисунке (Рис.2) и таблицах 2, 4, отображены 5 средних вариантов времени забора корешков для цитофизиологического исследования. По наибольшему среднему митотическому индексу – это на 36 час фиксации, судили о наиболее удобном времени обработки семян гороха стимулятором роста эмистимом С.

Таблицы: 1, 3. Одновременно отбирали такие же варианты корней проростков гороха, необрабо­танные стимулятором (вода) в качестве контроля. Это также 5 вариантов: 36 часов, 39 часов, 42 часа, 45 часов и 48 часов. Препараты, окрашенные ацетоорсеином, просматривали в 100 полях зрения в микроскопе при увеличении10х90 для каждого корня в 4-5 биологических повторностях. Вели подсчет, как общего числа клеток в каждом поле зрения, так и числа делящихся клеток по фазам митотического цикла. Анализируя данные контроля, мы имеем распределение митотических индексов по времени: 1 вариант 6,23%, 2 вариант 4,09%, 3 вариант 1,79%, 4 вариант 2,78%, 5 вариант 4,20%. (График не публикуется).

В опыте (обработка эмистимом С в концен­трации 10-9 М): 1 вариант 7,73%, 2 вариант 6,93%, 3 вариант 4,33%, 4 вариант 3,82%, 5 вариант 3,58%. В опыте митотический индекс выше, в профазах средние значения на порядок выше, чем в контроле. Смотри Рис. 2 «Митозы» и Рис.3 «Стимуляция по правилу доза-эффект».

По результатам приведенных данных можно сделать вывод, что почасовая фиксация показала тенденцию уменьшения величин митотических индексов от длительности времени прорастания. Через больший промежуток времени уменьшалось количество клеток, находящихся в митозе [1-3, 6, 13].

Согласно данным, приведенным в статье Цыганковой В.А. и авторов [12], «Молекулярно-генетический контроль ауксиновых сигналов: передача и реализация», генная экспрессия согласуется с молекулярно генетическим контролем ауксиновых сигналов. А эмистим С как раз и является биологическим комплексом, состоящим из гормонов ауксинового, гибберелино-цитокининового ряда, 15 типов аминокислот, олигосахаридов, жирных кислот, микроэлементов и витаминов. Он стимулирует рост и развитие практически всех сельскохозяйственных и декоративных культур. Он получен путем микробиологического синтеза на основе продуктов жизнедеятельности грибов везикулярно-арбус­кулярной микоризы из растений жень-шеня и облепихи. Препарат запатентован в Институте биоорганической химии и нефтехимии (г. Киев) и нашел свое широкое применение во многих зарубежных и странах СНГ [7, 9].

В обзоре [12] предоставлены данные относительно регуляторных компонентов путей сигналов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в растительной клетке (мембранные белки-рецепторы, чувствительные к экзогенным сигналам ИУК, система вторичных мессенджеров (цАМФ, цГМФ, инозитолтрифосфат и диацилглицерол, цитоплаз­матический кальций, «сенсорный» белок кальциевых сигналов – кальмодулин), которые опосредуют передачу сигналов ИУК от рецепторов на эффекторы (ферменты), катализирующие внутриклеточный метаболизм). Приведен список недавно идентифицированных генов, детерминирующих синтез белков-участников передачи сигналов ИУК у арабидопсиса: ген АВР1, кодирующий мембранный белок – рецептор ИУК; AtCP1 и AtCBL1 гены, кодирующие «сенсорные» белки кальция; многочисленные семейства MDR генов мембранных белков, которые включены в активный АТФ-зависимый транспорт протонов от ИУК через клеточные мембраны, PIN гены белков, контролирующих пассивный полярный интра - и интерклеточный транспорт анионов от ИУК; ARG1 и RCN1 гены белков, ответственных за передачу гравитропических сигналов и регулирующих транспорт анионных форм ИУК через мембраны специализированных гравичувствительных клеток – статоцитов; VTI гены SNARE белков-транспортеров, участвующих в везикулярном интраклеточном транспорте ИУК и AtMRP5 гены белков-транспортеров конъюгированных форм ИУК; ARF гены ауксин-активируемых трансфакторов, контро­лирующих экспрессию ранних/первичных ауксин-регулируемых Aux/IAA, SAUR, GH3 ACS генов, а также многочисленных семейств SKP1, RBX1, ATCUL1, ASK1, ASK2, AXR1, ECR1, RCE1, ENR2p, Cdc53p, Scp1p, TIR1 генов белков (составных убиквитин-белок лигазного комплекса) и CSN генов белков (составных мульти-субъединичного белкового регуляторного комплекса COP9 сигналосом) – компонентов убиквитин/протеосом-опосредованного пути распада Aux/IAA белков, репрессирующих передачу ауксиновых сигналов.

Рассмотрена гипотетическая модель регуляции экспрессии генов ИУК.

 Таблица 1.

Зависимость митотических индексов от времени в кончиках проростков корешков гороха

Контроль

Из расчета на каждые 100 полей зрения

Время

(час)

Число кл-к

всего в п/зр

Ч.кл. в

митозе

Ч. кл в

Профазе

Ч. кл. в

метафазе

Ч. кл. в

анафазе

Ч. кл. в

телофазе

Митотич.

Индекс

(%)

36

1729

107,5

51,25

25,5

8,25

22,5

6,231

39

1526

61,5

26

17

2,5

16

4,097

42

998

21

12,5

3

0,5

5

1,797

45

1492

50,5

25

10

4

11,5

2,781

48

1365

59

43

6,67

2

7,33

4,200

 

Таблица 2.

Зависимость митотических индексов от времени в корешках проростков гороха под действием эмистима С

Из расчета на каждые 100 полей зрения

Время

(час)

Число кл. в зоне

деления

Ч. кл. в митозе

Ч. кл. в профазе

Ч. кл. в метафазе

Ч. кл. в анафазе

Ч. кл. в телофазе

Митотич. Индекс

(%)

36

1615

120

70,67

17,33

9,33

22,67

7,729

39

2158,6

118,6

47,3

37,7

6,7

27

4,850

42

1210

51,5

36,5

5

4

6

4,330

45

1261,5

50

29,5

11,5

2

7

3,816

48

1366,7

45,67

30,33

8,67

2,33

4,33

3,584

 

Таблица 3.

Зависимость митотических индексов от времени в кончиках корешков проростков гороха

Контроль

Время

(час)

Число профаз

1

Число метафаз

2

Число анафаз

3

Число

телофаз

4

 %

профаз

5

 %

метафаз

6

 %

анафаз

7

 %

телофаз

8

 % Митотич.

Индексов

36

48,419

24,159

7,352

20,070

2,95

1,504

0,46

1,315

6,231

39

44,403

26,185

3,758

25,654

1,698

1,155

0,145

1,071

4,097

42

62,820

7,693

1,282

28,205

1,075

0,247

0,041

0,435

1,797

45

67,677

15,101

4,445

12,778

1,513

0,515

0,194

0,559

2,781

48

67,113

12,682

2,993

17,12

3,33

0,543

0,164

0,500

4,200

 

1,2,3,4 – % делящихся клеток по фазам цикла от числа делящихся клеток

5,6,7,8 – % делящихся клеток по фазам цикла от общего числа клеток в поле зрения

 

Таблица 4.

Зависимость митотических индексов от времени под действием эмистима С в кончиках корешков проростков гороха

Время

(час)

Кол-во

профаз

1

Кол. метаф

2

Кол.

анафаз

3

Кол-во

телофаз

4

 %

профаз

5

 %

метафаз

6

 %

анафаз

7

 %

телофаз

8

 %

Митот.

Индекс.

36

62,1

13,37

7,37

17,2

5,6

1,11

0,55

1,42

7,73

39

49,44

25,77

4,074

20,72

2,199

1,372

0,226

1,044

4,85

42

65,41

11,073

6,461

17,055

3,132

0,371

0,341

0,488

4,33

45

55,5

25,625

8,125

10,625

2,242

0,886

0,165

0,524

3,816

48

71,54

16,85

3,65

7,95

1,132

2,07

0,098

0,243

3,584

 

1,2,3,4 – % клеток в каждой фазе митоза от числа делящихся клеток

5,6,7,8 – % клеток в каждой фазе митоза от общего числа клеток


 

Рисунок 2. Влияние эмистима С на величину митотических индексов в меристеме гороха посевного на разных фазах клеточного цикла


Заключение

Сравнивая активность эмистима С на трех фазах клеточного цикла (по МИ в G0, G1, S) кончиков корешков проростков гороха посевного сорт Рапорт, можно сделать вывод, что наибольшей активации можно достичь, обрабатывая семена на стадии G0. (Рис. 3), где митотические индексы были на порядок выше по сравнению с контролем: 7,7 (на 36 час), 6,9 (на 39 час), 4,3 (на 42 час) и 3,8 (на 45 час), 3,6 (на 48 час), Рис. 2.

Из данных, проведенных в результате проведенных экспериментов следует, что клетки прорастающего семени гороха в период повышенной активности генома максимально чувствительны к действию физиологически активных веществ – эмистима С. На всех фазах клеточного цикла наблюдается чувствительность к действию физиологически активных веществ, находящихся в составе эмистима С. Причем действие это подчиняется правилу Арндта-Шульца (Arndt-Schultz), и выражается в периодических спадах и подъемах пиков активности (от 1 до 3 и более). Согласно этому правилу кривая доза-эффект имеет один максимум, но Попов, Иванова [4, 10] установили, что кривая имеет два и более максимумов, в ее ходе наблюдаются повторяемость форм в начальном, среднем и конечном интервалах, что дает возможность построить обобщенный график волнообразной кривой доза-эффект, где средний интервал соответствует максимуму кривой Арндта-Шульца и характеризуется несколькими (чаще всего двумя) максимумами и одним минимумом. Его обозначают как интервал насыщения. Конечный интервал характеризуется преобладанием торможения. Эти авторы указывают на то, что стимулирующий эффект не бывает стабильной, неизменной величиной, а зависит от реакции организма (главная волна) и от условий среды (второстепенные волны) [4, 7, 9, 10].

 

 

Рисунок 3. Влияние препарата эмистима С на стимуляцию роста проростков гороха посевного (корней и стеблей) в фазе G0.

 

Список литературы:
1. Борейко В.К., Калинин Ф.Л., Троян В.М. Торможение биосинтеза рибонуклеиновых кислот на протяжении пререпликативного периода клеточного цикла гидразидом малеиновой кислоты // Физиология и биохимия культурных растений. – 1979. – 11, № 2. – С.153-157.
2. Григорюк І.П., Нижник Т.П., Курчий Б.О. Регуляція вмісту абсцизової та емістимом С у посушливих умовах // Фізіологія та біохімія культурних рослин. – 2001. – 33, № 3. – С. 241-244.
3. Гродзинский Д.М., Белецкая Е.К., Хилько Т.Д., Кравцова Л.И. О чувствительности клеточной популяции апикальной меристемы стебля озимой пшеницы к воздействию низких температур // Физиология и биохи-мия культурных растений. – 1981. – 13, № 3. – С. 269-273.
4. Иванова И.А. Зависимость между реакцией и дозой у растительных организмов // Тезисы докладов между-народного симпозиума по стимуляции растений. – София. – 1966. – С. 11-12.
5. Кулаева О.Н. Определение кинетиновой активности с помощью биотестов. Методы определения регулято-ров роста и гербицидов: Сб. научных трудов. – Москва: Наука, 1966. – С.120-135.
6. Мусіяка В.К., Григорюк Т.І. Вивчення фізіологічної активності різних партій регулятору росту емістиму // Фізіологія та біохімія культурних рослин. – 2001. – 33, № 1. – С. 3-9.
7. Опис до патенту на винахід. Спосіб одержання регулятору роста рослин. Пономареноко С.П., Боровікова Г.С., Блізнюк С.Т., Ізжеурова В.В. АТ Високий врожай. – 1993.
8. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. – М.: Агропромиздат, 1988. – 271 с.
9. Пономаренко С.П. Регуляторы роста растений. Киев. – 2003. – 319 с.
10. Стимуляция растений. Доклады Международного симпозиума по стимуляции растений. – 1966: София, 25-30 октября 1966 г. – 127 с.
11. Троян В.М. Клітинний цикл рослин та його регуляція. – Київ: Наукова думка. – 1998. – 171 С.
12. V.A. Tsygankova, L.A. Galkina, L.I. Musatenko, K.M. Sytnik. 2007. Molecular-genetic control of auxin signals: transmission and realisation. //Botany and Mycology: modern horizons/Collection of papers devoted to the 80 anniversary of A.M. Grodzinky (1926-1988), Academician of Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv Academ-periodica, 2007. – p.189-231.
13. Quastler H. The analysis of cell population kineticks // Cell proliferation. Oxford, Blackwell. – 1963. – P. 18.
14. Stollerukraine.com – Биофордж (Bio-Forge): Уникальные свойства и преимущества использования. Stol-ler.USA/ Unleashing the Power of Plants.

 

Информация об авторах:

Рассоха Светлана Николаевна Svetlana Rassokcha

младший научный сотрудник отдела аллелопатии Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко, Национальный ботанический сад им. Н.Н. Гришко НАН Украины, 01014, Украина, г. Киев. ул. Тимирязевская, 1

M.M. Grishko National Botanical Gardens, National Academy of Sciences of Ukraine, 01014, Ukraine, Kyiv


Читателям

Информация о журнале

Выходит с 2013 года

ISSN: 2311-5459

Св-во о регистрации СМИ: 

ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013

ПИ №ФС77-66239 от 01.07.2016

Скачать информационное письмо

Включен в перечень ВАК Республики Узбекистан

Размещается в:

doi:

The agreement with the Russian SCI:

cyberleninka

google scholar

Ulrich's Periodicals Directory

socionet

Base

ROAR

OpenAirediscovery

CiteFactor

 

Поделиться

Лицензия Creative CommonsЯндекс.Метрика© Научные журналы Universum, 2013-2019
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Непортированная.