Международный
научный журнал

Действие фракций красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии, в системах in vitro и in vivo


Effect of red pigment fractions obtained by anion exchange chromatography in vitro and in vivo

Цитировать:
Действие фракций красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии, в системах in vitro и in vivo // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. Михайлова Е.В. [и др.]. 2016. № 12(30). URL: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/3964 (дата обращения: 02.06.2020).
 
Прочитать статью:

Keywords: amyloid, red pigment of yeast, albumin, protease

АННОТАЦИЯ

В настоящей работе проведен сравнительный анализ действия фракций красного пигмента, выделенного из Saccharomycescerevisiae, на бычий сывороточный альбумин in vitro, а также на цитотоксичность и накопление активных форм кислорода in vivo – в клетках дрожжей. Сравнение действия фракций, полученных с помощью анионообменной хроматографии, показало, что хотя обе фракции способны защищать белок от гидролиза сериновыми протеазами, одна из них действует более активно, вызывая, возможно, помимо этого, агрегацию самого белка. Обе фракции при этом нетоксичны для клеток, что в совокупности с ранее полученными данными о действии красного пигмента на моделях клонированных в дрожжах β-амилоида и α-синуклеина позволяет рассматривать красный пигмент как потенциальный противоамилоидный терапевтический агент.

ABSTRACT

A comparative analysis of the action of red pigment fractions isolated from Saccharomyces cerevisiae, on bovine albuminin vitro, and on toxicity and ROS accumulation in yeast cells in vivo was carried out. The comparison of fractions obtained by anion exchange chromatography revealed that although both groups are able to protect the protein (bovine serum albumin) from hydrolysis by serine proteases, one of them seems to be more active, causing, in addition, aggregation of the protein. Both fractions moreover appeared to be non-toxic for the cells. This data combined with the previously obtained data on the effects of red pigment on β-amyloid and α-synuclein reveals that the red pigment fractions can be considered as a potential therapeutic anti-amyloid agent.

 

I. Введение

Образование нерастворимых белковых отложений в тканях является диагностическим признаком целого ряда серьезных заболеваний человека различной этиологии: многочисленных губчатых энцефалопатий, болезни Альцгеймера, Гентингтона, Паркинсона, диабета II типа и др. [12, c. 1924]. Во многих случаях эти отложения формируются из упорядоченных образований, так называемых «амилоидов» [18, c. 262]. Морфологически амилоиды представляют собой линейные неразветвленные фибриллы длиной до нескольких микрометров и диаметром 10—20 нм, состоящие из отдельных протофиламентов, обогащенных β-структурами, расположенными перпендикулярно оси фибриллы [9, c. 2117]. Амилоидные фибриллы устойчивы к действию высокой температуры, денатурирующих агентов и к некоторым протеазам (химотрипсину и протеиназе К), а их способность специфически связывать некоторые низкомолекулярные соединения (Конго красный и тиофлавин T) широко используется для наблюдений за динамикой образования амилоидов в системах in vitro и в тканях млекопитающих [14, c. 1].

В настоящее время образование амилоидной фибриллы рассматривается как многостадийный процесс полимеризации, включающий реакцию нуклеации – сборки ядра полимера из нескольких растворимых белков с измененной конформацией [10, c. 1533]. Таким образом, в основе фибриллогенеза лежат нарушения фолдинга белков в результате мутаций, изменений pH и температуры, присутствия шаперонов, посттрансляционных модификаций.

Свой вклад в этот процесс при ряде патологий могут вносить свободные кислородные и азотные радикалы – супероксиданион, пероксидный радикал, пероксинитрит и др., при избыточном накоплении которых развивается окислительный стресс. Значительная роль этого патологического процесса подтверждена в развитии системных амилоидозов, болезней Альцгеймера и Паркинсона [5, с. 497]. Источником свободных радикалов, например, в ЦНС может служить микроглия [8, с. 2], также свободные радикалы накапливаются в клетке при запуске апоптоза.

Поиск веществ, влияющих на образование амилоидов, в настоящее время представляет несомненный практический интерес, так как частота амилоидных заболеваний в мире увеличивается, а эффективные препараты до сих пор находятся на разных стадиях разработки. Наиболее перспективными среди потенциальных лекарственных соединений в настоящее время считаются молекулы, способные подавлять путь фибриллогенеза, приводящий к накоплению токсичных интермедиатов [11, с. 136].

Ранее мы показали, что в клетках Saccharomyces cerevisiae, мутантных по генам ADE1 и ADE2 и вследствие этогонакапливающих так называемый «красный пигмент», наблюдается снижение общего уровня белков в амилоидной форме (по сравнению с белыми изогенными штаммами). Нами установлено, что красный пигмент влияет на кинетику образования фибрилл инсулина in vitro, вероятно, в результате связывания красного пигмента с фибриллами, что препятствует их росту и влияет на образование агрегатов [2]. Показано действие красного пигмента на экспрессированный в клетках дрожжей β-амилоид человека – суммарное количество цитоплазматических включений в клетке и агрегирование в присутствии пигмента заметно снижается [13].

Красный пигмент дрожжей относится к группе N-гетероциклических пигментов, в которую входят пурины, птерины и их производные, он представляет собой комплекс полимеров 5-аминоимидазолрибонуклеотида, дополнительно содержащих аминокислоты [16]. Молекулярная масса полимеров препарата природного красного пигмента дрожжей колеблется в диапазоне 2–10 кДа. [1, c. 857]. Вопрос о том, можно ли выделить фракцию пигмента, обладающую наиболее выраженной противоамилоидной активностью, до сих пор остается открытым. Также не ясен механизм противоамилоидного действия красного пигмента в клетках – он может как тормозить формирование агрегатов, так и приводить к их ремоделированию или растворению. Кроме того, он может способствовать конверсии уже сформированных агрегатов в аморфную нетоксичную форму.

Таким образом, задачами настоящей работы стало изучение влияния фракций природного красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии, на белок в модельной системе in vitro и на дрожжевые клетки. Изменения в процедуре выделения красного пигмента и данные о возможном механизме действия его наиболее активной фракции могут быть использованы при дальнейшей разработке лекарственной формы препарата.

II. Методика эксперимента

В настоящей работе использовали общепринятые обозначения генотипов и фенотипов штаммов S. cerevisiae (http: //www. yeastgenome. org/help/yeastGeneNomenclature. Shtml), а также стандартные среды для культивирования [15].

Пигмент выделяли из клеток штамма 23S (MATα ade2), любезно предоставленного А. Зехновым (Санкт-Петербургский государственный университет) на стационарной стадии роста (YEPD среда в течение 5 сут). Собранные клетки разрушали под действием температуры в лизисном буфере (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА). Остатки клеток удаляли центрифугированием (100 g, 1 мин). Надосадочную фракцию подвергали депротеинизации смесью хлороформ-метанол (3 : 7 об/об), выдерживали при 0 0С в течение 10 мин и центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. После 2 депротеинизаций и удаления органических растворителей проводили инкубацию в растворе проназы (1 мг/мл) (Sigma, США) в Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) в течение 8 часов при 37 0С. Далее проводили еще 2 депротеинизации для удаления проназы.

Выделенный исходный пигмент либо гидролизовали (далее обозначен Ргидр), как описано в [1, c. 854], либо водный раствор красного пигмента наносили на колонку (1,5 × 5 см), содержащую анионообменную смолу DEAE-Sepharose Fast Flow (GE Helthcare, Великобритания), которую промывали 0,1 М водным раствором НCl. При прохождении колонки по значению рН и интенсивности окрашивания красный пигмент разделяется на 2 фракции: первой элюируется фракция с рН = 7,5 (далее обозначен Р0), второй – фракция с рН = 2 (далее Р1) в соотношении 3 : 1 по объему.

Полученные фракции (Р1 предварительно нейтрализовали 1 M NaOH) наносили на колонки с Sephadex G-250 (GE Helthcare, Великобритания) для удаления низкомолекулярных примесей, после прохождения которых пигмент высушивали, а затем растворяли в деионизированной воде. Фракция Р0 характеризуется собственным пиком флюоресценции в области около 520 нм (рис. 1) (длина волны возбуждения 450 нм). Чтобы сравнить действие разных форм пигмента, мы приблизительно выравнивали их по концентрации и использовали в опытах 1,8 мМ растворы.

Рисунок 1. Спектры собственной флуоресценции фракций красного пигмента Р1 и Р0, полученных с помощью анионообменной хроматографии, при длине волны возбуждения 450 нм.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) (17 мкг в пробе) инкубировали в присутствии красного пигмента в течение 2 ч при 37 0С, после чего обрабатывали протеазой XIV типа из Streptomyces griseus (Sigma, США) (0,15 мкг/мкл пробы).

Для разделения агрегированных белков исполь­зовали электрофорез в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,1 % SDS (SFR agarose, Amresco, США)[6].

Цитотоксичность фракций красного пигмента и его способность индуцировать накопление свобод­ных радикалов оценивали методом проточной цитометрии на цитометре Coulter EPICS XL (Beckman Coulter, США), оснащенном аргоновым лазером (длина волны излучения 488 нм), при максимальной скорости подачи образца 1 мкл/с. Для оценки доли погибших клеток использовали йодистый пропидий (PI) – флуоресцентный краситель, проникающий в мертвые клетки и не окрашивающий живые [17]. Уровень окислительного стресса оценивали по накоплению активных форм кислорода (АФК), которое выявляли красителем 5 (6) — хлорметил-2,7-дихлордигидро флуоресцеин диацетатом (ДХДФДА).

Для статистической обработки данных и построения графиков использовали Excel 2010 (Microsoft, США). Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

III. Результаты и обсуждение

Ранее в своих работах по действию природного красного пигмента на рост амилоидных фибрилл [1, 2, 13] мы показали, что красный пигмент препятствует связыванию специфического красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Мы предполагаем, что это может объясняться прямой конкуренцией – красный пигмент блокирует сайты связывания тиофлавина Т на фибрилле, то есть можно представить, что пигмент выполняет роль «защитного покрытия». Мы попробовали определить в системе in vitro, является ли это протекторное действие строго специфичным для амилоидных фибрилл, или оно более универсально.

В качестве действующего агента выбрали сериновую протеазу из Streptomyces griseus, а в качестве модельного белка – БСА, для растворов которого характерно динамическое равновесие между мономерной и агрегированной (димерами, олигомерами и более крупными агрегатами) формами [4, с. 707]. Растворы БСА инкубировали с протеазой при 37 0С в течение 2 ч с добавлением либо Ргидр, либо фракций пигмента, полученных при анионообменной хроматографии, после чего пробы разделяли в агарозном геле. На рис. 2 при сравнении дорожек 1 и 2 хорошо видно, что за 2 ч протеаза полностью гидролизует БСА. Если к белку добавлены Ргидр или Р1, то гидролиз проходит лишь частично (дорожки 3 и 4, дорожки 5 и 6). Интересно отметить, что добавление к БСА самой фракции Р0 вызывает олигомеризацию белка – белковая полоса на дорожках 7 и 8 более диффузна по сравнению с дорожкой 2, а гидролиз практически отсутствует (дорожка 8).

Рисунок 2. Модифицирующее действие различных форм красного пигмента на активность сериновой протеазы.

Дорожки: 1 – действие сериновой протеазы на альбумин; 2 – альбумин; 3 – альбумин с добавлением Ргидр; 4 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением Ргидр; 5 – альбумин с добавлением фракции Р1; 6 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением фракции Р1; дорожка 7 – альбумин с добавлением фракции Р0; 8 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением фракции Р0.

Мы попытались также выяснить, какая именно часть молекулы полимера пигмента осуществляет защитную функцию. Для этого одновременно с фракциями красного пигмента мы проверили действие растворов рибозы и имидазола, взятых в эквимолярных концентрациях (0,05 М). На рис. 3 видно, что добавление к альбумину раствора имидазола вызывает ослабление гидролизной функции протеазы (дорожка 4), тогда как в присутствии рибозы альбумин гидролизуется полностью (дорожка 5).

Рисунок 3. Модифицирующее действие рибозы и имидазола на активность сериновой протеазы

Дорожки: 1 – альбумин; 2 – альбумин с добавлением имидазола; 3 – альбумин с добавлением рибозы; 4 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением имидазола; 5 – действие сериновой протеазы на альбумин с добавлением рибозы.

Исходя из полученных данных можно предположить, что в клетке красный пигмент ассоциирует с белковыми молекулами за счет имидазольного кольца. Хотя это взаимодействие носит неспецифический характер, в клетке пигмент скорее всего локализован совместно с амилоидами [3, 209], что способствует именно его высокой противоамилоидной активности. Можно предположить, что механизмом этой активности является блокировка доступа к амилоидам ферментов протеолиза или белков, участвующих в посттрансляционной модификации. В результате красный пигмент опосредованно препятствует образованию наиболее токсичных для клеток олигомеров и способствует перенаправлению агрегации по неамилоидному пути

Одним из несомненно практически важных свойств красного пигмента является то, что он не обладает выраженной токсичностью для эукариот [13]. Фракции красного пигмента, полученные с помощью анионообменной хроматографии, оценили по показателям цитотоксичности с использованием проточной цитометрии. Растворы P0 и P1 добавляли в синтетическую питательную среду, содержащую галактозу, и культивировали клетки штамма VSY71 (W303-1Atrp1-1::pRS304 TRP1+; ura3-1:: pRS306 URA3+) в течение 24 ч, после чего окрашивали PI и ДХДФДА. Результаты представлены на рис. 4. Можно видеть, что фракции Р0 (б) и Р1 (в) не вызывают изменений ни в уровне гибели клеток (верхний ряд), ни в количестве АФК (нижний ряд) по сравнению с контролем (а).

Рисунок 4. Цитотоксичность природного красного пигмента (а) и фракций Р0 (б) и Р1 (в) в отношении клеток штамма VSY71. Результаты окрашивания йодидом пропидия и ДХДФДА


Таким образом, анализ фракций природного красного пигмента, полученных с помощью анионообменной хроматографии (Р1 и Р0) показал, что хотя они обе способны защищать белок от действия протеаз, фракции различаются по своей активности в системе in vitro. Р0 действует более активно, при этом, возможно, даже вызывая некоторую дополнительную агрегацию белка. При этом обе фракции не являются токсичными для клеток и не вызывают в них накопления АФК, то есть не индуцируют окислительный стресс. В сочетании с ранее полученными данными о потенциальном терапевтическом действии красного пигмента на моделях клонированных в дрожжах β-амилоида [13] и α-синуклеина [3] результаты настоящей работы позволяют рассматривать красный пигмент как перспективный потенциальный противоамилоидный агент, несомненными достоинствами которого являются отсутствие токсичности и относительно невысокая стоимость производства.

 


Список литературы:

1. Амен Т.Р. Михайлова Е.В., Аленин В.В., Артемов А.В., Дементьев П.А., Ходорковский М.А., Артамоно-ва Т.О., Кузнецова И.М., Сойдла Т.Р. Сравнительная структурная и функциональная характеристика раз-ных форм красного пигмента дрожжей Saccharomyces cerevisiae и его синтетического аналога // Цитология. – 2012. – Т.54. – № 11. – С. 853–861.
2. Михайлова Е.В., Артемов А.В., Снигиревская Е.С., Артамонова Т.О., Ходорковский М. А., Сойдла Т. Р., Невзглядова О. В. Влияние красного пигмента Saccharomyces cerevisiae на образование инсулиновых фиб-рилл in vitro // Цитология. – 2011. – Т. 53. – № 10. – С. 808–814.
3. Невзглядова О.В., Артемов А.В., Михайлова Е.В., Люблинская О.Г., Озерова Ю.Э., Иванова П.А., Костыле-ва Е.И., Сойдла Т.Р. Влияние красного пигмента дрожжей Saccharomyces cerevisiae на проявление клониро-ванного α-синуклеина человека // Цитология. – 2016. – Т. 58. – № 3. – С. 201–212.
4. Поляничко А.М., Михайлов Н.В., Романов Н.М., Баранова Ю.Г., Чихиржина Е.В. Межмолекулярные взаи-модействия сывороточного альбумина в растворе // Цитология. – 2016. – Т. 58. – № 9. – С. 707—713.
5. Ando Y., Nyhlin N., Suhr O., Holmgren G., Uchida K., el Sahly M., Yamashita T., Terasaki H., Nakamura M., Uchino M., Ando M. Oxidative stress is found in amyloid deposits in systemic amyloidosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1997. – V. 232. – № 2. – P. 497–502.
6. Bagriantsev S. N., Liebman S. W. Modulation of Abeta42 low-n oligomerization using a novel yeast reporter sys-tem // BMC Biol. – 2006. – V.4. – P. 32.
7. Bauer C.A., Löfqvist B., Pettersson G. Studies on the catalytic mechanism of a serine protease from Streptomyces griseus // Eur. J. Biochem. – 1974 – V. 41. – № 1. – P. 45–49.
8. Bernhardi von R., Bernhardi L.E., Eugenín J. Microglial cell dysregulation in brain aging and neurodegeneration // Front Aging Neurosci. – 2015. – V. 7. – P. 124. doi: 10.3389/fnagi.2015.00124.
9. Herczenik E., Gebbink M. F.B.G. Molecular and cellular aspects of protein misfolding and disease // FASEB J. – 2008. – V.22. – P. 2115–2133.
10. Knowles T. P. J., Waudby C. A., Devlin G. L., Cohen S. I. A., Aguzzi A., Vendruscolo M., Terentjev E. M., Welland M.E., Dobson C. M.. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly // Science. – 2009. –
V. 326. – P. 1533—1537.
11. Martins P. True and apparent inhibition of amyloid fibril formation // Prion. – 2013. – V. 7. – P. 136–139.
12. Merlini G., Seldin D. C., Gertz M. A. Amyloidosis: pathogenesis and new therapeutic options // J. Clin. Oncol. – 2011. – V. 29. – № 14. – P. 1924–1933.
13. Nevzglyadova O.V., Mikhailova E.V., Amen T.R., Zenin V.V., Artemov A.V., Kostyleva E.I., Mezhenskaya D.A., Rodin D.I., Saifitdinova A.F., Khodorkovskii M.A., Sarantseva S. ., Soidla T.R. Yeast red pigment modifies Amy-loid beta growth in Alzheimer disease models in both Saccharomyces cerevisiae and Drosophila melanogaster // Amyloid. – 2015. – V.8. – P. 1–12.
14. Rajamohamedsait H. B., Sigurdsson E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue // Methods Mol. Biol. – 2012. – V. 849. – doi. 10.1007/978-1-61779-551-0_28.
15. Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning. A laboratory manual // NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – 2222 p.
16. Smirnov M.N., Smirnov V.N., Budowsky E.I., Inge-Vechtomov S.G., Serebrjakov N.G. Red pigment of adenine-deficient yeast Saccharomyces cerevisiae // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1967. – V. 2. – P. 299–304.
17. Tenreiro S., Reimao-Pinto M. M, Antas P., Rino J., Wawrzycka D., Macedo D., Rosado-Ramos R., Amen T., Waiss M., Magalhaes F., Gomes A., Santos C.N., Kaganovich D., Outeiro T. F. Phosphorylation modulates clearance of alpha-synuclein inclusions in a yeast model of Parkinson’s disease // PLoS Genet. – 2014. – V. 10. P. e1004302.
18. Uversky V. N. Amyloidogenesis of natively unfolded proteins // Curr. Alzheimer Res. – 2008. – V.5. – P.260–287.

Информация об авторах:

Михайлова Екатерина Вячеславовна Mikhailova Ekaterina

Кандидат биологических наук, научный сотрудник, федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии, 194064, Россия, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

Candidate of Biological Sciences, Research scientist, Federal State Budget Institution of Science Institute of Cytology, 194064, Russia, St. Petersburg, Tikhoretsky av., 4


Озерова Юлия Эдуардовна Ozerova Julia

Студент 1 курса магистратуры, федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский технологический институт», 190013, Россия, Санкт-Петербург, Московский пр., 26

A 1st year master’s degree student, the Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "Saint-Petersburg Institute of Technology", 190013, Russia, St. Petersburg, Moscowskiy Av., 26


Иванова Полина Андреевна Ivanova Polina

Студент 1 курса магистратуры, федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», 195251, Россия, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29

A 1st year master’s degree student, the Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "Saint Petersburg State Polytechnic University", 195251, Russia, St. Petersburg, Politehnicheskaja Str., 29


Невзглядова Ольга Всеволодовна Nevzglyadova Olga

Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии, 194064, Россия, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

Candidate of Biological Sciences, Senior Research scientist, Federal State Budget Institution of Science Institute of Cytology, 194064, Russia, St. Petersburg, Tikhoretsky av., 4


Журнал зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор), регистрационный номер ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013
Учредитель журнала - ООО «МЦНО»
Главный редактор - Ларионов Максим Викторович

Читателям

Информация о журнале

Выходит с 2013 года

ISSN: 2311-5459

Св-во о регистрации СМИ: 

ЭЛ №ФС77-55878 от 17.06.2013

Скачать информационное письмо

Включен в перечень ВАК Республики Узбекистан

Размещается в:

doi:

The agreement with the Russian SCI:

cyberleninka

google scholar

Ulrich's Periodicals Directory

socionet

Base

ROAR

OpenAire